pH和CO2对大鼠肺微血管和主动脉内皮细胞NOS活性及mRNA 表达的影响
作者：杜以梅 金咸容
单位：杜以梅(同济医科大学 生理学教研室)；金咸容(同济医科大学病理生理学教研室，武汉 430030)
关键词：
中国应用生理学杂志000125 为从蛋白水平和基因表达水平探讨NO在高碳酸血症引起肺血管收缩而导致肺动脉 高压 中的作用环节，本实验采用体外培养大鼠肺微血管内皮细胞(PMECs)，分别研究单纯改变pH 与单纯改变CO2浓度对其一氧化氮合酶(NOS)活性及其mRNA表达的影响，并比较 PMECs和 大血管主动脉内皮细胞(AECs)的异同。
1 材料和方法
用SD大鼠按Chen方法在pH 7.4、5%CO2、37℃ DMEM液中分离和培养PMECs和 AECs 。取ECs(1～2代)以1×105Cell/ml传代于预先放有盖玻片的培养瓶内，12 h后吸弃 DMEM 液，用37℃ D-Hanks液(p H7.4)冲洗三次，分为五组，每组6～10块盖玻片。对照组：pH 7.35～7.45、5%CO2；高pH组：pH7.6～7.8、5%CO2；低pH组：pH 6.8～7.0 、5%CO2;低 CO2组：pH 7.35～7.45、3%CO2：高 CO2组：pH 7.35～7.45、 8%CO2；以上五组均在37℃ DMEM液中培养12 h。NOS活性检测按戴爱国方法采用还原型 辅酶Ⅱ黄递酶细胞化学染色后在光学显微镜下每张玻片连续计数100个细胞，其结果采用目 测半定量法，即：深蓝色-强阳性反应(+++)；蓝色-中等阳性反应(++)；浅蓝色-阳性 (+)；介于浅蓝色与背景色之间-可疑阳性反应(±)：与背景色一样-阳性反应(-)。NOS MRNA表达按张晨辉方法行RT-PCR反应，反应完成后取10 μl PCR反应物进行1.0%琼脂 糖凝胶电泳，以PCR marker，为分子量标准。RT-PCR以凝胶电泳结果条带的大小和深浅判 定表达的水平，用多媒体彩色病理分析系统在测量窗下测量照片中条带积分光密度(OD)， 其大小与mRNA量成反比并作图。以上数据用Ridit法分析统计。
, 百拇医药
2 结果
单纯改变pH PMECs和AECs的NOS活性均为高pH组>对照组>低pH组，差别有显著意义( P<0.05)；而单纯改变CO2不同的各组无显著意义(P>0.05)；以相同的条件下培 养的两种 ECs相比较，AECs活性高于PMECs，各组差异均有显著意义(P<0.05)表 1， 2)。NOS mRNA表达的变化趋势同NOS活性(图1，2)。Tab.1 Changes in the activities of NOS of PMECs G
Grades of reaction
Total
RI±1/3n
R2±1/3n
-
, 百拇医药
±
+
++
+++
NC
29
189
479
251
43
1000
0.5±0.018
0.5±0.018
, 百拇医药
pH(high)
9
144
392
385
70
1000
0.59±0.018*
0.5±0. 018
pH(low)
243
274
, 百拇医药 350
33
0
900
0.255±0.019*
0.5 ±0.019
CO23%
24
160
376
193
47
800
, 百拇医药
0.504±0.02
0.5 ±0.02
CO28%
21
153
387
198
41
800
0.507±0.02
0.5 ±0.02
* P<0.05,vs NCTab.2 Changes in the activities of NOS of AECs G
, 百拇医药
Grades of reaction
Total
RI±1/3n
R2±1/3n
-
±
+
++
+++
NC
0
79
253
, 百拇医药
187
81
600
0.5±0.024
0.61±0. 024#
pH(high)
4
54
161
175
206
600
0.625±0.024*
, 百拇医药
0.6 48±0.024#
pH(low)
85
137
185
79
14
500
0.283±0.026*
0.606±0.02 6#
CO23%
, 百拇医药
7
104
342
227
120
800
0.490±0.020
0.594±0.020 #
CO28%
4
106
338
, http://www.100md.com
248
104
800
0.495±0.020
0.595±0.020 #
* P<0.05,vs NC;# P<0.05,vs PMECs3 讨论
在NO生成过程中，NOS是合成NO的唯一限速酶，检测NOS mRNA和 NOS活性可在转录和蛋 白水平了解NOS基因表达的情况，并在一定程度上反映NO生成的情况。
CO2对肺血管的直接作用尚有争议，有收缩、舒张和无影响三种不同报道，其作用是 否是内皮依赖的也有不同的报道。我们的研究表明单纯改变CO2浓度对PMECs NOS活性及mR NA表达无明显影响，即 CO2不直接引起PMECs NO生成的变化，而一定范围内 pH升高可增 加 PMECs活性及mRNA表达，一定范围内 pH降低可抑制之，与Mitcher等报道相似。推测一定 范围内pH降低抑制NOS mRNA表达可能与 NOS活性降低有因果关系。虽然有人提出细胞外pH升 高通过激活细胞膜上的Na+/H+交换，继而激活Na+/Ca2+交换，致大量细胞外 Ca2+内流，使细胞内Ca2+浓度升高，从而使ECs NO生成增多，但pH变化通过何 种机制影响ECs NOS基因表达的仍需继续研究。总之，我们认为高碳酸血症引起血管收缩的 作用，如果是经过减少ECs NO生成的途径，也可能是因降低了pH而起作用的。
, 百拇医药
Fig.1 Effect of pH on NOS mRNA expressi on of PMECs/AECs
Fig.2 Effect of CO2 on NOS mRNA expre ssion of PMECs/AECs
本实验还发现AECs NOS活性及mRNA表达明显高于 PMECs与 Kelm等报道相似，提示ECs间 存在异质性。大血管和微血管NO释放量的不同可能与其局部受血压、血流量和剪切力等影响 不同有关，还可能与培养的 ECs活力不同有关。这种异质性有何生理意义仍待研究，但提示 在研究ECs的生理和病理生理作用时应注意不同血管段的异质性。
国家自然基金资助课题，NO.39370328
收稿日期：1998年 6月23日；修回日期：1999年8月30日, 百拇医药
单位：杜以梅(同济医科大学 生理学教研室)；金咸容(同济医科大学病理生理学教研室，武汉 430030)
关键词：
中国应用生理学杂志000125 为从蛋白水平和基因表达水平探讨NO在高碳酸血症引起肺血管收缩而导致肺动脉 高压 中的作用环节，本实验采用体外培养大鼠肺微血管内皮细胞(PMECs)，分别研究单纯改变pH 与单纯改变CO2浓度对其一氧化氮合酶(NOS)活性及其mRNA表达的影响，并比较 PMECs和 大血管主动脉内皮细胞(AECs)的异同。
1 材料和方法
用SD大鼠按Chen方法在pH 7.4、5%CO2、37℃ DMEM液中分离和培养PMECs和 AECs 。取ECs(1～2代)以1×105Cell/ml传代于预先放有盖玻片的培养瓶内，12 h后吸弃 DMEM 液，用37℃ D-Hanks液(p H7.4)冲洗三次，分为五组，每组6～10块盖玻片。对照组：pH 7.35～7.45、5%CO2；高pH组：pH7.6～7.8、5%CO2；低pH组：pH 6.8～7.0 、5%CO2;低 CO2组：pH 7.35～7.45、3%CO2：高 CO2组：pH 7.35～7.45、 8%CO2；以上五组均在37℃ DMEM液中培养12 h。NOS活性检测按戴爱国方法采用还原型 辅酶Ⅱ黄递酶细胞化学染色后在光学显微镜下每张玻片连续计数100个细胞，其结果采用目 测半定量法，即：深蓝色-强阳性反应(+++)；蓝色-中等阳性反应(++)；浅蓝色-阳性 (+)；介于浅蓝色与背景色之间-可疑阳性反应(±)：与背景色一样-阳性反应(-)。NOS MRNA表达按张晨辉方法行RT-PCR反应，反应完成后取10 μl PCR反应物进行1.0%琼脂 糖凝胶电泳，以PCR marker，为分子量标准。RT-PCR以凝胶电泳结果条带的大小和深浅判 定表达的水平，用多媒体彩色病理分析系统在测量窗下测量照片中条带积分光密度(OD)， 其大小与mRNA量成反比并作图。以上数据用Ridit法分析统计。
, 百拇医药
2 结果
单纯改变pH PMECs和AECs的NOS活性均为高pH组>对照组>低pH组，差别有显著意义( P<0.05)；而单纯改变CO2不同的各组无显著意义(P>0.05)；以相同的条件下培 养的两种 ECs相比较，AECs活性高于PMECs，各组差异均有显著意义(P<0.05)表 1， 2)。NOS mRNA表达的变化趋势同NOS活性(图1，2)。Tab.1 Changes in the activities of NOS of PMECs G
Grades of reaction
Total
RI±1/3n
R2±1/3n
-
, 百拇医药
±
+
++
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NC
29
189
479
251
43
1000
0.5±0.018
0.5±0.018
, 百拇医药
pH(high)
9
144
392
385
70
1000
0.59±0.018*
0.5±0. 018
pH(low)
243
274
, 百拇医药 350
33
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900
0.255±0.019*
0.5 ±0.019
CO23%
24
160
376
193
47
800
, 百拇医药
0.504±0.02
0.5 ±0.02
CO28%
21
153
387
198
41
800
0.507±0.02
0.5 ±0.02
* P<0.05,vs NCTab.2 Changes in the activities of NOS of AECs G
, 百拇医药
Grades of reaction
Total
RI±1/3n
R2±1/3n
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NC
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, 百拇医药
187
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0.5±0.024
0.61±0. 024#
pH(high)
4
54
161
175
206
600
0.625±0.024*
, 百拇医药
0.6 48±0.024#
pH(low)
85
137
185
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500
0.283±0.026*
0.606±0.02 6#
CO23%
, 百拇医药
7
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342
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120
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0.490±0.020
0.594±0.020 #
CO28%
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106
338
, http://www.100md.com
248
104
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0.495±0.020
0.595±0.020 #
* P<0.05,vs NC;# P<0.05,vs PMECs3 讨论
在NO生成过程中，NOS是合成NO的唯一限速酶，检测NOS mRNA和 NOS活性可在转录和蛋 白水平了解NOS基因表达的情况，并在一定程度上反映NO生成的情况。
CO2对肺血管的直接作用尚有争议，有收缩、舒张和无影响三种不同报道，其作用是 否是内皮依赖的也有不同的报道。我们的研究表明单纯改变CO2浓度对PMECs NOS活性及mR NA表达无明显影响，即 CO2不直接引起PMECs NO生成的变化，而一定范围内 pH升高可增 加 PMECs活性及mRNA表达，一定范围内 pH降低可抑制之，与Mitcher等报道相似。推测一定 范围内pH降低抑制NOS mRNA表达可能与 NOS活性降低有因果关系。虽然有人提出细胞外pH升 高通过激活细胞膜上的Na+/H+交换，继而激活Na+/Ca2+交换，致大量细胞外 Ca2+内流，使细胞内Ca2+浓度升高，从而使ECs NO生成增多，但pH变化通过何 种机制影响ECs NOS基因表达的仍需继续研究。总之，我们认为高碳酸血症引起血管收缩的 作用，如果是经过减少ECs NO生成的途径，也可能是因降低了pH而起作用的。
, 百拇医药
Fig.1 Effect of pH on NOS mRNA expressi on of PMECs/AECs
Fig.2 Effect of CO2 on NOS mRNA expre ssion of PMECs/AECs
本实验还发现AECs NOS活性及mRNA表达明显高于 PMECs与 Kelm等报道相似，提示ECs间 存在异质性。大血管和微血管NO释放量的不同可能与其局部受血压、血流量和剪切力等影响 不同有关，还可能与培养的 ECs活力不同有关。这种异质性有何生理意义仍待研究，但提示 在研究ECs的生理和病理生理作用时应注意不同血管段的异质性。
国家自然基金资助课题，NO.39370328
收稿日期：1998年 6月23日；修回日期：1999年8月30日, 百拇医药