25例肝癌中p16基因状态的研究
作者：黄建钊 沈文律 夏穗生 李波 罗义刚 姜汉英
单位：黄建钊 夏穗生 姜汉英(同济医科大学器官移植研究所，湖北武汉430031)；沈文律 李波 罗义刚(华西医科大学附一院普外科，四川成都610041)
关键词：肝癌;p16基因;缺失;突变;甲基化
癌症000113
摘 要：目的：研究原发性肝细胞性肝癌中p16基因的状态。方法：采用多重PCR分析法、SSCP分析法及以PCR为基础的甲基化分析法分别对四川地区人群25例原发性肝细胞性肝癌标本及其相应的癌旁组织中p16基因的缺失、突变及甲基化情况进行了检测。结果：25例肿瘤标本中，发现3例p16基因缺失，其中2例纯合子缺失，1例半合子缺失，未发现1例突变，在未发现基因缺失的22例肿瘤标本中发现6例有p16基因高甲基化存在。全部相应的癌旁组织中均未发现有p16基因缺失、突变或甲基化存在。结论：p16基因的异常改变在原发性肝癌的发生与发展中可能起重要作用，其改变以甲基化为主。
, 百拇医药
分类号：R737.9 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0045-03
The status of p16 gene in primary hepatocellular
carcinoma from a Chinese population
HUANG Jian zhao, SHEN Wen lu,(Institute of Organ Transplantation, Tongji Medical University, Wuhan 430031,P.R.China)
XIA Sui sheng, et al.
(Department of General Surgery,the First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041,P.R.China)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To investigate the status of p16 gene in primary hepatocellular carcinoma (HCC). Methods：A total of 25 HCC samples with correspondant tumor-adjacent specimens were screened for p16 gene deletions,mutations and hypermethylations,by using multiplex polymerase chain reaction (PCR),single strand conformational polymorphism(SSCP) and PCR based methylation analysis,respectively. Results： Among 25 HCC samples, 2 homozygous and 1 hemizygous deletions and 6 hypermethylations were detected and no mutations were idendtified.However,no deletions,mutations or hypermethylations were found in all the tumor-adjacent tissues. Conclusion： The abnormal alterations of p16 gene may play an important role in the carcen genesis of primary hepatocellular carcinoma.
, http://www.100md.com
Key words：Primary hepatocellular carcinoma; p16 gene; Deletion; Mutaion; Hypermethylation. ▲
p16基因,也称MTSI/CDKN2/p16ink4，定位于人染色体9p21区，其编码蛋白为p16,作为CDK4与CDK6的抑制因子，在细胞周期调控中起负性调节作用,防止细胞过度增殖。p16基因的失活与多种肿瘤的发生及发展有关,失活方式主要以基因缺失为主,而突变则较少见[1～3]。最近的研究发现许多肿瘤中p16基因5'CpG岛(富含G、C的区域)常表现高度甲基化并伴随基因失活[4～6]。甲基化作为p16基因的另一失活方式已引起重视,有关原发性肝细胞性肝癌(hepataocellular carcinoma,HCC)中p16基因的状态的报道较少见，本文对25例四川地区人群原发性肝细胞性肝癌标本及其相应的癌旁组织中p16基因的缺失、突变及甲基化情况进行了检测，现报告于下。
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1材料与方法
1.1标本来源
25例原发性肝细胞性肝癌及其相应的癌旁组织标本均为手术切除标本，标本一经切除后，立即取材并置-80℃冻存。
1.2DNA提取
参照《分子克隆》方法提取基因组DNA。测定OD260与OD280比值在1.8～2.0之间。
1.3多重PCR分析法
我们用此法检测25例HCC肿瘤组织及其相应的癌旁组织中p16基因第1外显子与第2外显子的缺失情况。以染色体9p的标记点多态性双核苷酸重复序列D9s162为内对照。全部引物由北京赛百盛公司合成，其序列及合成的DNA片段大小分别为：
p16基因第1外显子
, 百拇医药
5'GAAGAAAGAGGAGGGGCTG3'
5'GCGCTACCTGATTCCAATTC3'(340bp)
p16基因第2外显子
5'GGAAATTGGAAACTGGAAGC3'
5'TCTGAGCTTTGGAAGCTCT3'(509bp)D9s162
5'GCAATGACCAGTTAAGGTTC3'
5'AATTCCCACAACAAATCTCC3'(172-196bp)
将用于扩增p16基因第1外显子与第2外显子的引物分别与作为内对照的D9s162的引物混合加入PCR反应液中同时扩增。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳分离后,用Bio-Rad公司的Gs-250MolecularImageSystem使PCR产物电泳带在计算机上显像并作分析。若p16/D9s162电泳条带密度比在对照的10%以下，判为纯合子缺失，若为50%左右，则判为半合子缺失。
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1.4单链构像多态性分析(SSCP)
据文献报道[3]，p16基因的点突变90%发生在第2外显子，因此，我们只对第2外显子进行检测。用PCR法扩增第2外显子，扩增结束后，用限制性内切酶SmaI(Boehringer Mannheim)将PCR产物切成252bp与257bp大小两个片断，变性后，行10%聚丙稀酰胺凝胶电泳，室温1.5w过夜。电泳结束后，行银染,显色并作分析[8]。
1.5以PCR为基础的甲基化分析
以PCR为基础的甲基化分析法参照已发表的文献[6～9]。我们用此法分析位于5'CpG岛内的p16基因第1外显子的甲基化情况，采用在p16基因第1外显子序列内有酶切位点的甲基敏感的限制性内切酶SmaI作为基因组DNA的消化酶，以不含SmaI位点的染色体9p标记点多态性双核苷酸序列，D9s162作为内对照。扩增所用的p16基因第1外显子与D9s162的引物均同前。取1μg基因组DNA，以10USmaI25℃消化8小时后，再以10USmaI消化过夜，以此消化好的DNA作为模板，同时扩增p16基因第1外显子与D9s162。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳后，在计算机上显像并作分析。若出现p16基因第1外显子的扩增产物，则提示有甲基化存在。
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2结果
2.1p16基因缺失情况
用多重PCR分析法在25例HCC肿瘤标本中发现3例有p16基因缺失，其中2例为纯合子缺失，1例为半合子缺失。而全部癌旁组织中均未发现有p16基因缺失。图1显示2例肿瘤组织p16基因纯合子缺失。
图1 多重PCR扩增结果
2、4、6、8道为肿瘤标本；1、3、5、7道为相应的癌旁组织标本;M为分子量参照物。
6、8道肿瘤组织中p16基因第2外显子PCR产物条带强度极低,几乎消失,显示纯合子缺失
2.2p16基因突变情况
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用SSCP分析法在25例HCC肿瘤组织及癌旁组织中未发现1例有异常泳动的单链DNA电泳带，即未发现1例有突变存在。
2.3p16基因甲基化情况
用PCR为基础的甲基化分析法在25例HCC肿瘤组织中检出6例(24%)p16基因5'CpG岛甲基化，而全部癌旁组织中均未发现有p16基因甲基化存在。图2显示，全部内对照D9s162均被扩增出，有4例肿瘤组织出现p16基因外显子1的扩增产物，提示有甲基化，而其相应的癌旁组织均未见p16基因外显子1的产物。
图2以PCR为基础的甲基化分析结果
2、4、6、8道为肿瘤标本;1、3、5、7道为相应的癌旁组织标本;M为分子量参照物；
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2、6、8、10道肿瘤组织中出现p16基因第1外显子的扩增产物,提示甲基化
3讨论
原发性肝细胞性肝癌是一种常见的恶性肿瘤，死亡率极高，至目前为止，其发生的分子机制还不太清楚。现有的研究表明，原癌基因ras、c-myc、c-fos等的激活与抑癌基因p53及Rb的失活与HCC的发生、发展有关[10]。
p16基因是迄今为止发现的最为广泛的抑癌基因之一，参与多种肿瘤的发生与发展。有关p16基因在HCC中状态的研究报道较少，且结果差异较大。我们在25例HCC肿瘤标本中发现3例(12%)有p16基因缺失，而无1例有突变，相应的癌旁组织中则均未发现有缺失或突变。提示p16基因的缺失在HCC的发生与发展中可能起一定作用。Biden[11]与Kaino[12]等分别对澳大利亚人群HCC的原发肿瘤及日本人群HCC的癌细胞株作了p16基因缺失与突变的检测，结果均未发现异常改变。而Chaubert等则在瑞典人群HCC的原发肿瘤中检出21%的p16基因缺失率及15.4%的突变率[13]。我们的结果与其它作者报道的结果的差异可能与不同地区HCC的病因不同有关。总的看来，p16基因的缺失或突变在HCC中并不高。
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最近的研究发现p16基因另一重要失活机制，即5'CpG岛高甲基化，在多种肿瘤的发生与发展中起重要作用[4～6]，特别是在一些过去未发现有p16基因缺失与突变的肿瘤，如结肠癌中，也发现p16基因甲基化而引起的基因失活[4]，将有关基因甲基化的研究推向了高潮，但目前为止，有关HCC中p16基因甲基化的情况罕见报道。我们用PCR为基础的甲基化分析法，对本组标本中p16基因第1外显子内的SmaI位点的甲基化情况作了检测，结果发现6例(24%)肿瘤组织有p16基因甲基化存在，而全部癌旁组织则均未检出有甲基化存在。提示p16基因的甲基化在HCC的发生与发展中可能起重要作用。
本研究发现的p16基因在原发性肝癌中的异常改变率达36%，包括缺失与甲基化。提示p16基因的异常改变与HCC的关系密切，进一步研究p16基因对HCC的治疗作用具有重大意义。
*通讯作者：Tel：86-27-83611175
, http://www.100md.com
Fax：86-27-83646605
E-mail：iot@tjh.tjmu.edu.cn
参考文献：
[1]Kamb A,Grusi NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types [J]. Science, 1994, 264： 436～ 439.
[2]Nobori F,Miura M,Wu D. T,et al.Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple cancers [J]. Nature, 1994, 368(21)： 753～ 756.
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[3]Uchida F,Kinoshita F,Saita H,et al. CDKN2 (MTS1/p16INK4A) gene alterations in hematological malignancies [J]. Leuk-lymphoma, 1997, 24(5～ 6)： 449～ 461.
[4]Herman JG, Merlo A, Mao L,et al. Inactivation of the CDKN2/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers [J]. Cancer Res, 1995,55(20)： 4525～ 4530.
[5]Lo KW,Cheung ST, Leung SF,et al. Hypermethylation of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Res,1996,56(6)： 2721～ 2725.
, 百拇医药
[6]Delgado B.M, Piqueras J.F,Garcia M.J,et al.Hypermehylation of 5' CpG island of p16 is a frequent event in non-Hodgkin' s lymphoma [J]. Leukemia, 1997,11(3)： 425～ 428.
[7]Lo KW, Huang DP, Lan KM. p16 gene alterations in nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Res, 1995, 55(10)： 2039～ 2043.
[8]李家良，杨光华，李甘地,等.银染PCR-SSCP方法检测恶性纤维组织细胞瘤p53基因点突变[J].中华肿瘤杂志，1996,18(1)：13～ 15.
[9]Gonzalez-Zulueta M, Bender CM, Yang AS,et al. Methylation of the 5'CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing [J]. Cancer Res,1995,55(10)： 4531～ 4535.
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[10]Tabor E.Tumor suppressor genes,growth factor genes,and oncogenes in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma [J]. J Med Virol, 1994, 42(4)： 357～ 365.
[11]Biden K, Young J, Buttenshaw R,et al. Frequency of Mutation and deletion of the tumor suppressor Gene CDKN2A(MTS1/p16) in hepatocellular carcinoma from an Australian population
[J]. Hepatology, 1997, 25(3)： 593～ 597.
[12]Kaino M. Alterltions in the tumor supyressor genes p53,RB,p16/MTS1,and p15/MTS2 in human pancreatic cancer and hepatoma cell lines [J]. J Gastroenterol, 1997, 32 (1)： 40～ 46.
[13] Chaubert P, Gayer R, Zimmermann A, et al. Germ-line mutaions of the p16 INK4 (MTS1) gene occur in a subset of patients with hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology,1997， 25(6)： 1376～ 1381.
收稿日期：1999-02-12
修回日期：1999-03-19, 百拇医药
单位：黄建钊 夏穗生 姜汉英(同济医科大学器官移植研究所，湖北武汉430031)；沈文律 李波 罗义刚(华西医科大学附一院普外科，四川成都610041)
关键词：肝癌;p16基因;缺失;突变;甲基化
癌症000113
摘 要：目的：研究原发性肝细胞性肝癌中p16基因的状态。方法：采用多重PCR分析法、SSCP分析法及以PCR为基础的甲基化分析法分别对四川地区人群25例原发性肝细胞性肝癌标本及其相应的癌旁组织中p16基因的缺失、突变及甲基化情况进行了检测。结果：25例肿瘤标本中，发现3例p16基因缺失，其中2例纯合子缺失，1例半合子缺失，未发现1例突变，在未发现基因缺失的22例肿瘤标本中发现6例有p16基因高甲基化存在。全部相应的癌旁组织中均未发现有p16基因缺失、突变或甲基化存在。结论：p16基因的异常改变在原发性肝癌的发生与发展中可能起重要作用，其改变以甲基化为主。
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分类号：R737.9 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0045-03
The status of p16 gene in primary hepatocellular
carcinoma from a Chinese population
HUANG Jian zhao, SHEN Wen lu,(Institute of Organ Transplantation, Tongji Medical University, Wuhan 430031,P.R.China)
XIA Sui sheng, et al.
(Department of General Surgery,the First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041,P.R.China)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To investigate the status of p16 gene in primary hepatocellular carcinoma (HCC). Methods：A total of 25 HCC samples with correspondant tumor-adjacent specimens were screened for p16 gene deletions,mutations and hypermethylations,by using multiplex polymerase chain reaction (PCR),single strand conformational polymorphism(SSCP) and PCR based methylation analysis,respectively. Results： Among 25 HCC samples, 2 homozygous and 1 hemizygous deletions and 6 hypermethylations were detected and no mutations were idendtified.However,no deletions,mutations or hypermethylations were found in all the tumor-adjacent tissues. Conclusion： The abnormal alterations of p16 gene may play an important role in the carcen genesis of primary hepatocellular carcinoma.
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Key words：Primary hepatocellular carcinoma; p16 gene; Deletion; Mutaion; Hypermethylation. ▲
p16基因,也称MTSI/CDKN2/p16ink4，定位于人染色体9p21区，其编码蛋白为p16,作为CDK4与CDK6的抑制因子，在细胞周期调控中起负性调节作用,防止细胞过度增殖。p16基因的失活与多种肿瘤的发生及发展有关,失活方式主要以基因缺失为主,而突变则较少见[1～3]。最近的研究发现许多肿瘤中p16基因5'CpG岛(富含G、C的区域)常表现高度甲基化并伴随基因失活[4～6]。甲基化作为p16基因的另一失活方式已引起重视,有关原发性肝细胞性肝癌(hepataocellular carcinoma,HCC)中p16基因的状态的报道较少见，本文对25例四川地区人群原发性肝细胞性肝癌标本及其相应的癌旁组织中p16基因的缺失、突变及甲基化情况进行了检测，现报告于下。
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1材料与方法
1.1标本来源
25例原发性肝细胞性肝癌及其相应的癌旁组织标本均为手术切除标本，标本一经切除后，立即取材并置-80℃冻存。
1.2DNA提取
参照《分子克隆》方法提取基因组DNA。测定OD260与OD280比值在1.8～2.0之间。
1.3多重PCR分析法
我们用此法检测25例HCC肿瘤组织及其相应的癌旁组织中p16基因第1外显子与第2外显子的缺失情况。以染色体9p的标记点多态性双核苷酸重复序列D9s162为内对照。全部引物由北京赛百盛公司合成，其序列及合成的DNA片段大小分别为：
p16基因第1外显子
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5'GAAGAAAGAGGAGGGGCTG3'
5'GCGCTACCTGATTCCAATTC3'(340bp)
p16基因第2外显子
5'GGAAATTGGAAACTGGAAGC3'
5'TCTGAGCTTTGGAAGCTCT3'(509bp)D9s162
5'GCAATGACCAGTTAAGGTTC3'
5'AATTCCCACAACAAATCTCC3'(172-196bp)
将用于扩增p16基因第1外显子与第2外显子的引物分别与作为内对照的D9s162的引物混合加入PCR反应液中同时扩增。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳分离后,用Bio-Rad公司的Gs-250MolecularImageSystem使PCR产物电泳带在计算机上显像并作分析。若p16/D9s162电泳条带密度比在对照的10%以下，判为纯合子缺失，若为50%左右，则判为半合子缺失。
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1.4单链构像多态性分析(SSCP)
据文献报道[3]，p16基因的点突变90%发生在第2外显子，因此，我们只对第2外显子进行检测。用PCR法扩增第2外显子，扩增结束后，用限制性内切酶SmaI(Boehringer Mannheim)将PCR产物切成252bp与257bp大小两个片断，变性后，行10%聚丙稀酰胺凝胶电泳，室温1.5w过夜。电泳结束后，行银染,显色并作分析[8]。
1.5以PCR为基础的甲基化分析
以PCR为基础的甲基化分析法参照已发表的文献[6～9]。我们用此法分析位于5'CpG岛内的p16基因第1外显子的甲基化情况，采用在p16基因第1外显子序列内有酶切位点的甲基敏感的限制性内切酶SmaI作为基因组DNA的消化酶，以不含SmaI位点的染色体9p标记点多态性双核苷酸序列，D9s162作为内对照。扩增所用的p16基因第1外显子与D9s162的引物均同前。取1μg基因组DNA，以10USmaI25℃消化8小时后，再以10USmaI消化过夜，以此消化好的DNA作为模板，同时扩增p16基因第1外显子与D9s162。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳后，在计算机上显像并作分析。若出现p16基因第1外显子的扩增产物，则提示有甲基化存在。
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2结果
2.1p16基因缺失情况
用多重PCR分析法在25例HCC肿瘤标本中发现3例有p16基因缺失，其中2例为纯合子缺失，1例为半合子缺失。而全部癌旁组织中均未发现有p16基因缺失。图1显示2例肿瘤组织p16基因纯合子缺失。
图1 多重PCR扩增结果
2、4、6、8道为肿瘤标本；1、3、5、7道为相应的癌旁组织标本;M为分子量参照物。
6、8道肿瘤组织中p16基因第2外显子PCR产物条带强度极低,几乎消失,显示纯合子缺失
2.2p16基因突变情况
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用SSCP分析法在25例HCC肿瘤组织及癌旁组织中未发现1例有异常泳动的单链DNA电泳带，即未发现1例有突变存在。
2.3p16基因甲基化情况
用PCR为基础的甲基化分析法在25例HCC肿瘤组织中检出6例(24%)p16基因5'CpG岛甲基化，而全部癌旁组织中均未发现有p16基因甲基化存在。图2显示，全部内对照D9s162均被扩增出，有4例肿瘤组织出现p16基因外显子1的扩增产物，提示有甲基化，而其相应的癌旁组织均未见p16基因外显子1的产物。
图2以PCR为基础的甲基化分析结果
2、4、6、8道为肿瘤标本;1、3、5、7道为相应的癌旁组织标本;M为分子量参照物；
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2、6、8、10道肿瘤组织中出现p16基因第1外显子的扩增产物,提示甲基化
3讨论
原发性肝细胞性肝癌是一种常见的恶性肿瘤，死亡率极高，至目前为止，其发生的分子机制还不太清楚。现有的研究表明，原癌基因ras、c-myc、c-fos等的激活与抑癌基因p53及Rb的失活与HCC的发生、发展有关[10]。
p16基因是迄今为止发现的最为广泛的抑癌基因之一，参与多种肿瘤的发生与发展。有关p16基因在HCC中状态的研究报道较少，且结果差异较大。我们在25例HCC肿瘤标本中发现3例(12%)有p16基因缺失，而无1例有突变，相应的癌旁组织中则均未发现有缺失或突变。提示p16基因的缺失在HCC的发生与发展中可能起一定作用。Biden[11]与Kaino[12]等分别对澳大利亚人群HCC的原发肿瘤及日本人群HCC的癌细胞株作了p16基因缺失与突变的检测，结果均未发现异常改变。而Chaubert等则在瑞典人群HCC的原发肿瘤中检出21%的p16基因缺失率及15.4%的突变率[13]。我们的结果与其它作者报道的结果的差异可能与不同地区HCC的病因不同有关。总的看来，p16基因的缺失或突变在HCC中并不高。
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最近的研究发现p16基因另一重要失活机制，即5'CpG岛高甲基化，在多种肿瘤的发生与发展中起重要作用[4～6]，特别是在一些过去未发现有p16基因缺失与突变的肿瘤，如结肠癌中，也发现p16基因甲基化而引起的基因失活[4]，将有关基因甲基化的研究推向了高潮，但目前为止，有关HCC中p16基因甲基化的情况罕见报道。我们用PCR为基础的甲基化分析法，对本组标本中p16基因第1外显子内的SmaI位点的甲基化情况作了检测，结果发现6例(24%)肿瘤组织有p16基因甲基化存在，而全部癌旁组织则均未检出有甲基化存在。提示p16基因的甲基化在HCC的发生与发展中可能起重要作用。
本研究发现的p16基因在原发性肝癌中的异常改变率达36%，包括缺失与甲基化。提示p16基因的异常改变与HCC的关系密切，进一步研究p16基因对HCC的治疗作用具有重大意义。
*通讯作者：Tel：86-27-83611175
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Fax：86-27-83646605
E-mail：iot@tjh.tjmu.edu.cn
参考文献：
[1]Kamb A,Grusi NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types [J]. Science, 1994, 264： 436～ 439.
[2]Nobori F,Miura M,Wu D. T,et al.Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple cancers [J]. Nature, 1994, 368(21)： 753～ 756.
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[4]Herman JG, Merlo A, Mao L,et al. Inactivation of the CDKN2/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers [J]. Cancer Res, 1995,55(20)： 4525～ 4530.
[5]Lo KW,Cheung ST, Leung SF,et al. Hypermethylation of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Res,1996,56(6)： 2721～ 2725.
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[7]Lo KW, Huang DP, Lan KM. p16 gene alterations in nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Res, 1995, 55(10)： 2039～ 2043.
[8]李家良，杨光华，李甘地,等.银染PCR-SSCP方法检测恶性纤维组织细胞瘤p53基因点突变[J].中华肿瘤杂志，1996,18(1)：13～ 15.
[9]Gonzalez-Zulueta M, Bender CM, Yang AS,et al. Methylation of the 5'CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing [J]. Cancer Res,1995,55(10)： 4531～ 4535.
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[11]Biden K, Young J, Buttenshaw R,et al. Frequency of Mutation and deletion of the tumor suppressor Gene CDKN2A(MTS1/p16) in hepatocellular carcinoma from an Australian population
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[12]Kaino M. Alterltions in the tumor supyressor genes p53,RB,p16/MTS1,and p15/MTS2 in human pancreatic cancer and hepatoma cell lines [J]. J Gastroenterol, 1997, 32 (1)： 40～ 46.
[13] Chaubert P, Gayer R, Zimmermann A, et al. Germ-line mutaions of the p16 INK4 (MTS1) gene occur in a subset of patients with hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology,1997， 25(6)： 1376～ 1381.
收稿日期：1999-02-12
修回日期：1999-03-19, 百拇医药