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编号:10232120
骨肉瘤中cbfa1基因表达与临床因素的相关性研究
http://www.100md.com 《中华骨科杂志》 2000年第1期
     作者:郭卫

    单位:北京医科大学人民医院骨肿瘤科 100044

    关键词:骨肉瘤;成骨细胞;基因表达;骨钙素;转录因子

    中华骨科杂志000104

    【摘要】目的 cbfa1基因是一种结合在Osteocalcin启动子上并能调节其在成骨细胞中表达的转录因子,在成骨细胞的分化和成熟中起着重要的作用。由于cbfa1基因在成骨细胞分化过程中所起的重要作用,研究骨肉瘤中cbfa1的表达有重要的意义。方法 应用Southernblot法和RT-PCR技术对43例骨肉瘤标本和3株骨肉瘤细胞系(SaOS-2、HOS和U-2)中cbfa1基因的结构和表达进行了研究。结果 在43例骨肉瘤标本中未发现cbfa1基因重排、缺失或扩增的现象。43例骨肉瘤标本中27例(63%)及3株骨肉瘤细胞检出cbfa1的mRNA。但cbfa1的表达水平,在大多数的骨肉瘤细胞中低于正常淋巴细胞的表达。Osteocalcin(cbfa1的靶基因)的表达,在大多数骨肉瘤标本中与cbfa1基因的表达是平行的。cbfa1转录水平和患者生存率之间在统计学上有明显的相关性。结论 肿瘤中有cbfa1基因表达的患者比缺乏这种基因表达的患者有更长的生存期。cbfa1基因表达可能是骨肉瘤中成骨细胞分化水平的一个标记。
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    Variable expression of the cbfa1 transcription factor gene in osteosarcoma

    GUO Wei

    (Department of Orthopaedics, Peoples Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044, China)

    【Abstract】 Objective Cbfa1, encoding a transcription factor which binds the promoter of the osteocalcin gene and regulating its expression in osteoblasts, has been found to play a central role in the differentiation and maturation of osteoblasts. Cbf1 gene belongs to a family of transcription factors involved in oncogenic transformation, and rearrangements of other members. It has been associated with specific types of leukemia. Because of the significant role of the cbfa1 gene in osteoblast differentiation, study of cbfa1 gene status could be of considerable interest in osteosarcoma. Methods A total of 43 specimens of OS encountered from 1990 to 1995 were collected at Memorial Sloan- Kettering Cancer Center from 25 biopies, 12 en bloc resections and 6 metastasectomy operations. The patients included 28 males and 15 females, and the mean age was 25 years. The primary tumor was studied in 35 cases, and metastatic tumors in 6 local recurrence in 2. The structure and expression of the cbfa1 gene were studied in 43 osteosarcoma samples and three osteosarcoma cell lines (SaOS- 2, HOS and U- 2) by quantitative Southern blot and RT- PCR techniques. Results We found no evidence of cbfa1 gene rearrangement, deletion or amplification in 43 osteosarcoma samples. Cbfa1 mRNA was detected in 27 of 43 (63% ) osteosarcoma samples and all three osteosarcoma cell lines. Cbfa1 transcript levels were variable, and in the majority of osteosarcomas were lower than in normal lymphocytes which are reported to express 20- fold less cbfa1 mRNA than normal osteoblasts. Expression of osteocalcin, a target gene of cbfa1, parallels with that of cbfa1 in most osteosarcoma samples. A statistical correlation between the cbfa1 transcript and disease free survival was observed. Conclusion The patients with cbfa1 expression in tumors had a longer survival period than those patients lacking expression of the gene in tumors. Cbfa1 expression may be a marker for the level of osteoblast differentiation in osteosarcoma.
, 百拇医药
    【Key words】 Osteosarcoma; Osteoblasts; Gene expression; Osteocalcin; Transcription factors

    骨肉瘤被认为是起源于间充质细胞向成骨细胞系统分化的肿瘤,由不同成熟阶段的成骨细胞组成。合成碱性磷酸酶(AP)是成骨细胞分化的一个早期标志,成熟的成骨细胞还产生Osteopontin(OP)、osteonectin(ON)和Osteocalcin。可惜的是AP、ON和OP都不是成骨细胞分化的特异性标志,Osteocalcin仅在分化成熟的成骨细胞中表达[1-3]。因此,这种特异性的成骨细胞基因表达是一种敏感而特异的标志物。Osteocalcin被发现在大多数骨肉瘤中表达,并被认为可用于鉴别骨肉瘤与骨的其它恶性肿瘤[4,5]。cbfa1(core-bindingfactora1)编码一个转录因子,结合到Osteocalcin基因的启动子上并调节它在成骨细胞中的表达,这在成骨细胞的分化和成熟中是十分重要的[6-10]。cbfa1基因表达是受高度限制的。在成年鼠的Northernblot分析中发现cbfa1基因的转录仅在骨和成骨细胞中被检出,而在其它组织中未被发现,尤其在成纤维细胞、成肌细胞、成软骨细胞等三种间充质来源的细胞中也无cbfa1基因表达[8]。cbfa1基因属于肿瘤形成过程中的一族转录因子,其中包括cbfβ基因,其重排能导致白血病[11,12]。cbfa1基因在正常组织和肿瘤组织成骨细胞的分化中都有重要的作用。因此,我们使用Southernblot法和RT-PCR技术研究43例骨肉瘤标本和3株骨肉瘤细胞系中作为成骨细胞分化标记物的cbfa1基因表达及在骨肉瘤中是否有cbfa1基因结构的改变。
, 百拇医药
    材料与方法

    一、标本

    标本来自美国MemorialSloan-kettering肿瘤中心,1990~1995年间获得的43例经病理证实的骨肉瘤标本,其中25例活检标本、12例整体切除标本和6例转移灶切除标本。本组男28例,女15例,平均年龄25岁。原发肿瘤35例,转移瘤6例,2例为局部复发。

    二、Southernblot法

    骨肉瘤组织中DNA基因组的分离采用的是标准的有机方法。定量的(10μg)DNA和EcoRⅠ一起在37℃下消化5~20h,用质量分数为0.9%的agarose凝胶分离并转移至尼龙膜。紫外线照射5min后,预杂交至少1h,随后将606bp的cbfa1基因片段与用随机引物技术进行标记的具有高度特异活性的cDNA探针相杂交。cbfa1cDNA探针是用RT-PCR技术得到的,其引物序列如下:
, 百拇医药
    (1)TGGGACTGTGGTTACTGTCA

    (2)CTGGGGTCTGAAAAAGGG

    杂交后,尼龙膜被严格的冲洗并直接经phosphorimager扫描(BioRad,Hercules,CA)。D12S2探针作对照。

    三、RT-PCR

    总RNA从液氮冷冻的肿瘤组织中分离,并应用胍异硫氰酸盐(Tel-Test,Friendswood,TX)结合苯氯仿提取和异丙醇沉淀。RNA悬浮在diethylpyrocarbonate水中,采用分光光度法测定浓度,并保存在-70℃。PCR的引物根据发表的序列设计[8,13]。引物设计跨越内边界,并不检出假基因等。它们不受任何用DNA为模板产生的预期大小的产物的影响。

    cbfa1引物序列如下:
, 百拇医药
    上游:5'CACGACAACCGCACCATG3'

    下游:5'GTCCCATCTGGTACCTCTCCG3'

    osteocalcin的引物序列如下:

    上游:5'ATGAGAGCCCTCAGACTCCTC3'

    下游:5'CGGGCCGTAGAAGCGCCGATA3'

    2μg总RNA在42℃下用randomhexamers逆转录为cDNA,含100u的superscriptⅡRT(GIBCOBRL,Gaithersburg,MD)和20u的RNA抑制剂(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)。逆转录后,酶和原先的cDNA被置入95℃中5min,再放入冰水中5min,每个cDNA样本用水连续稀释为1∶1、1∶5、1∶10、1∶100。各个样本的PCR反应在不同的cDNA浓度中按对数阶段进行[14]。最后我们选择1∶5的稀释液作为标准浓度,大多数样本的PCR以此为基础获得结果,5μl的cDNA样本稀释液(1∶5)与包括AmpliTaqDNA多聚酶(Perkin-ElmerCetus,Norwalk,CT)、dNTP、buffer和各种引物一起共25μl混合反应。在94℃中变性1min,退火1min,72℃延长1min,最后在72℃扩展5min,共扩增35个周期。PCR产物在质量分数为2%的agarose凝胶中电泳(cbfa1cDNA,165bp和osteocalcin,294bp),用phosphorimager(BioRad,Hercules,CA)测定。Phosphoglyceratekinase(PGK)引物用作内参照。
, 百拇医药
    PGK引物的序列为:

    正:5'GAGTTTGGAGCTCCTGGAAG3'

    反:5'TGCAAATCCAGGGTGCAGTG3'

    产物的大小为265bp。

    在每个反应中cbfa1mRNA值的计算与PGKmRNA有关。每个样本都包括没加cDNA的阴性对照。PCR产物用质量分数为1%的agarose凝胶分离,随后转移至尼龙膜。在经紫外线照射1min后,滤膜被预杂交至少1h,随后用cbfa1或osteocalcin特异性的32P标记的低聚核苷酸探针杂交。

    低聚核苷酸探针的序列为:

    cbfa1:5'CAGCCCCAACTTCCTGTGCTCGGT3'
, 百拇医药
    Osteocalcin:5'TCTCTTCACTACCTCGCTGCCCT3'

    杂交后,滤膜被严格的冲洗并置于-70℃暴露在X线片下曝光1~2d。

    四、统计学分析

    Fisher精确检验用于评估两个变量之间的差异。Kaplan-Meier曲线和对数试验用于评估cbfa1基因表达和无瘤生存期之间的关系。

    结果

    一、cbfa1基因形态的Southernblot分析

    在43例骨肉瘤中采用定量Southernblot分析,cbfa1探针用来检测在EcoRⅠdigestedgenomicDNA中的两个带,测量分别为12kb和2.3kb。没有1例cbfa1基因出现基因重排、缺失或扩增(图1)。
, 百拇医药
    图1 骨肉瘤标本中cbfa1基因的Southern印记。以D12S2

    为负荷对照。PL(胎盘DNA)用作正常对照

    二、骨肉瘤中cbfa1基因的转录水平

    取12例正常血的标本,作为淋巴细胞和骨肉瘤细胞中cbfa1转录水平的对照。据报道cbfa1mRNA在骨和成骨细胞中的表达水平比T淋巴细胞高20倍[10]。本研究中,43例骨肉瘤中27例(63%)标本可以测得cbfa1mRNA(图2)。cbfa1的转录水平是可变的,在大多数的骨肉瘤标本中cbfa1mRNA水平低于正常淋巴细胞(图3)。

    图2骨肉瘤cbfa1PCR产物和相应的寡聚核苷酸探针
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    杂交的印记

    图3 43例骨肉瘤cbfa1mRNA的表达水平,用正常白细胞的cbfa1mRNA水平作为参考

    三、骨肉瘤中Osteocalcin的表达

    OsteocalcinmRNA在43例骨肉瘤标本中的38例可被测得(图4)。高水平的表达(OC/PGK>0.5)24例,低水平的表达(OC/PGK<0.5)14例。Osteocalcin的表达在90%的标本与cbfa1平行。

    a OC,DNA band b OC,cDNA 294bp

    图4 骨肉瘤中的骨钙素PCR产物
, 百拇医药
    和相应寡聚核苷酸探针杂交的印记

    四、cbfa1基因表达与临床因素的相关性

    cbfa1基因转录和临床因素相关性的总结见表1。cbfa1基因转录和患者生存率的关系经Kaplan-Meier程序绘图,曲线用对数试验比较。证实cbfa1基因转录和患者生存率之间存在统计学的相关性。肿瘤中表达cbfa1的患者比缺乏基因表达的患者生存期长(图5,P=0.043)。本组未发现cbfa1基因表达与亚型、转移或化疗反应之间存在相关性(表2)。

    表2 cbfa1表达和临床因素的关系 类型

    转移

    化疗反应

    生存情况

    有(16)
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    无(27)

    良好(15)

    较差(25)

    DFS(31)

    D or AWD(12)

    cbfa1mRNA阳性

    9(56%)

    17(63%)

    10(67%)

    15(60%)

    21(68%)

    5(42%)
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    cbfa1mRNA阴性

    7(44%)

    10(37%)

    5(33%)

    9(40%)

    10(32%)

    7(58%)

    P(双侧χ2检验)

    NS

    NS

    0.043

    注:NS:差异无显著性意义
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    表1 临床、组织学和分子生物学资料 病例编号

    年龄(岁)

    性别

    原发或转移

    亚型

    化疗反应

    转移

    状态

    cbfa1 mRNA

    OC mRNA

    随访(月)

    OS27

, 百拇医药     34

    女

    M

    CHOND

    Ⅰ

    +

    DFS

    +

    La

    36

    OS29

    20

    男

, 百拇医药     P

    CHOND

    Ⅱ

    +

    AWE

    +

    Hb

    55

    OS34

    16

    男

    P

    CHOND

, 百拇医药     Ⅱ

    -

    DFS

    +

    L

    65

    OS38

    7

    男

    P

    OSTEOB

    Ⅳ

    -

    DFS
, 百拇医药
    +

    H

    54

    OS41

    48

    男

    P

    CHOND

    Ⅰ

    +

    DFS

    +

    H

    42
, 百拇医药
    OS42

    19

    男

    P

    CHOND

    Ⅰ

    -

    AWD

    -

    L

    12

    OS65

    48

    男
, 百拇医药
    M

    OSTEOB

    Ⅰ

    +

    D

    -

    L

    36

    OS71

    19

    男

    P

    OSTEOB

    Ⅰ
, 百拇医药
    -

    DFS

    +

    H

    43

    OS77

    60

    女

    P

    FIBROB

    ND

    -

    AWD

    -
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    L

    7

    OS80

    46

    男

    P

    OSTEOB

    Ⅰ

    -

    DFS

    +

    H

    4

    OS81
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    10

    女

    P

    OSTEOB

    Ⅱ

    -

    DFS

    +

    L

    30

    OS85

    34

    男

    P
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    FIBROB

    Ⅰ

    -

    D

    +

    H

    22

    OS87

    33

    女

    P

    OSTEOB

    Ⅱ

    +
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    AWD

    -

    L

    27

    OS89

    18

    男

    P

    FIBROB

    ND

    -

    DFS

    +

    L
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    34

    OS90

    19

    男

    P

    FIBROB

    Ⅱ

    -

    DFS

    -

    L

    7

    OS91

    22
, 百拇医药
    男

    P

    OSTEOB

    Ⅲ

    -

    DFS

    +

    H

    28

    OS92

    17

    男

    P

    FIBROB
, 百拇医药
    Ⅳ

    +

    D

    +

    H

    17

    OS93

    32

    女

    P

    OSTEOB

    Ⅰ

    +

    DFS
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    +

    H

    15

    OS95

    71

    女

    P

    FIBROB

    ND

    +

    DFS

    -

    L

    6
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    OS96

    16

    女

    P

    OSTEOB

    Ⅱ

    -

    DFS

    +

    H

    27

    OS97

    43

    男
, 百拇医药
    M

    OSTEOB

    Ⅱ

    +

    DFS

    +

    H

    62

    OS98

    31

    女

    P

    TELANGI

    Ⅲ
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    -

    DFS

    +

    H

    30

    OS99

    22

    女

    P

    OSTEOB

    Ⅲ

    -

    DFS

    +
, 百拇医药
    H

    16

    OS100

    25

    男

    M

    OSTEOB

    Ⅲ

    +

    DFS

    -

    L

    62

    OS103
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    19

    女

    P

    OSTEOB

    ND

    +

    AWD

    -

    L

    12

    OS104

    14

    男

    P
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    FIBROB

    Ⅱ

    +

    D

    +

    H

    6

    OS105

    14

    男

    P

    CHOND

    Ⅲ

    -
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    DFS

    +

    H

    17

    OS106

    13

    女

    P

    OSTEOB

    Ⅳ

    -

    DFS

    -

    H
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    29

    OS108

    8

    男

    P

    CHOND

    Ⅰ

    -

    DFS

    -

    L

    14

    OS109

    35
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    男

    P

    OSTEOB

    Ⅱ

    -

    DFS

    +

    H

    24

    OS110

    37

    男

    P

    CHOND
, 百拇医药
    Ⅰ

    -

    DFS

    -

    L

    18

    OS115

    16

    男

    P

    SPINDLE

    Ⅳ

    -

    DFS
, 百拇医药
    +

    H

    10

    OS117

    16

    男

    P

    CHOND

    Ⅲ

    -

    DFS

    +

    H

    22
, 百拇医药
    OS118

    12

    男

    P

    OSTEOB

    Ⅳ

    -

    DFS

    +

    H

    20

    OS119

    15

    男
, 百拇医药
    P

    OSTEOB

    Ⅲ

    -

    DFS

    +

    H

    38

    OS120

    11

    女

    P

    OSTEOB

    Ⅲ
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    +

    DFS

    -

    L

    17

    OS121

    16

    男

    P

    OSTEOB

    Ⅱ

    +

    AWD

    +
, 百拇医药
    H

    12

    OS122

    19

    男

    P

    CHOND

    Ⅰ

    -

    DFS

    +

    L

    20

    OS123
, 百拇医药
    17

    女

    P

    OSTEOB

    Ⅰ

    -

    DFS

    -

    H

    20

    OS124

    14

    女

    P
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    OSTEOB

    Ⅲ

    -

    DFS

    -

    H

    17

    OS125

    15

    女

    P

    OSTEOB

    Ⅱ

    -
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    DFS

    +

    H

    8

    OS126

    24

    男

    P

    OSTEOB

    Ⅱ

    +

    AWD

    -

    H
, 百拇医药
    36

    OS127

    17

    男

    M

    TELANGI

    Ⅲ

    +

    DFS

    -

    L

    24

    注:DFS:无瘤生存,D:死亡,AWD:带瘤生存,P:原发,M:转移,a:低,OC/PGK<0.5(PGK,磷酸甘油激酶),b:高,OC/PGK>0.5
, 百拇医药
    图5 43例骨肉瘤患者的cbfa1mRNA表达和

    无瘤生存率的关系(Log-rank检验,P=0.028)

    讨论

    前期的研究发现cbfa1是成骨细胞特异性的转录因子,并调节成骨细胞分化[6-9]。纯合子的cbfa1裸鼠表达与成骨细胞相关的基因非常低:如碱性磷酸酶、Osteopontin和Osteocalcin,可能与缺乏cbfa1有关[7]。骨肉瘤源于间充质细胞向成骨细胞的分化。我们通过对43例骨肉瘤标本的Southernbolt分析未发现cbfa1基因重排、缺失或扩增的证据。在骨肉瘤标本中的cbfa1基因转录水平比正常淋巴细胞低,这可能是由于cbfa1基因转录在骨肉瘤中是下调或削弱的。cbfa1基因转录在成骨细胞中应比淋巴细胞中高20倍[10]。低的cbfa1基因表达可能在肿瘤的发生或发展中有重要作用,或者仅反映骨肉瘤细胞分化阶段。cbfa1基因的丢失或减少表达的机制可能是由于基因的细小改变,如突变或转录过程中的问题,需进一步研究。可能有一些骨肉瘤细胞中cbfa1mRNA的表达水平相当低,以致我们不能用常规的PCR方法测定。我们发现cbfa1基因的表达和患者生存率之间有显著的相关性。肿瘤细胞中表达cbfa1基因的患者比缺乏其表达的患者生存期长。
, 百拇医药
    研究发现cbfa1基因能与Osteocalcin的启动子结合而调节其表达[15,16]。Osteocalcin和cbfa1基因在大多数骨肉瘤标本中转录水平的一致支持先前的观点。由于Osteocalcin通常仅存在于成熟成骨细胞中,cbfa1基因可能是通过调节Osteocalcin的表达在成骨细胞分化中起作用。cbfa1基因的表达仅在骨和成骨细胞中,先前的研究未发现cbfa1基因在成纤维细胞、肌源细胞或软骨母细胞中的转录[8]。我们未发现cbfa1表达和骨肉瘤亚型之间存在相关性。这可能是由于骨肉瘤细胞的异型性。

    在另外的研究中,32例软骨肉瘤中4例测得cbfa1基因,其中3例为Ⅲ级去分化软骨肉瘤,其中可能有些细胞分化成骨细胞样细胞。据报道cbfa1基因在软骨母细胞中可被测得,但不存在于分化成熟的软骨细胞中[8]。一些Ⅲ级的软骨肉瘤表达成骨细胞特异性基因(如Osteocalcin或cbfa1)更可能是成软骨细胞性骨肉瘤而非传统的软骨肉瘤。cbfa1mRNA在12例尤文肉瘤中有2例被测得,此现象一个可能的解释是在标本中存在正常的骨,另一种可能是尤文肉瘤中有一些细胞向成骨细胞分化。骨骼组织是由多种类型的间充质细胞组成的,包括:成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞等。这些细胞来源于正常的间充质细胞前体细胞。这些具有多向分裂能力的间充质细胞,在分化过程中根据某些特殊细胞类型的成熟阶段获得特殊的表型。例如已证实在1例软骨肉瘤中存在一序列不同表型的肿瘤细胞[17]。我们认为虽然cbfa1基因对于成骨细胞具有特异性,但它仍难作为诊断标志物使用,因为骨肉瘤中细胞存在异型性。在本研究中显示所有的淋巴细胞样本都有cbfa1mRNA表达。先前的研究显示在T细胞系中有cbfa1基因的表达,但不存在于B细胞系中。这使人得出这样的结论cbfa1基因可能与T淋巴细胞特异性转录调节有关[7]
, 百拇医药
    参考文献

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    (收稿日期:1999-11-08), http://www.100md.com