神经生长因子对周围神经再生的影响
作者：赵凤仪 周佩兰 赵卫生 王瑞林 杨明富 孔令震 张铁良
单位：赵凤仪(300211 天津医院骨研所)；周佩兰 孔令震(300211 天津医院骨研所手外科)；赵卫生(300211 天津医院骨研所肌电图室)；王瑞林(300211 天津医院骨研所病理科)；杨明富 张铁良(300211 天津医院骨研 所创伤科)
关键词：
中华骨科杂志000116
躯体运动神经元对NGF是否具有应答能力至今尚缺乏直接证据[1,2]，我们采用自体静脉+基底膜+NGF桥接兔坐骨神经15mm缺损，探讨外源性NGF对运动神经元再生的促进作用。
材料与方法
一、实验动物分组与桥接体制备
, http://www.100md.com
健康兔24只，重约2.0～2.5kg。随机分为实验组(静脉+基底膜+NGF)和对照组(静脉+基底膜+NS)。每组12只。取自体臀外静脉，长度25～30mm。基底膜取顺产胎儿羊膜，洗涤，去上皮细胞，修剪，备用。NGF(1000u/ml)由军事科学院第三研究所提供。
二、手术方法
兔耳缘静脉麻醉，显露右侧坐骨神经，切断造成15mm缺损，植入桥接体用静脉套接法吻合。
四、检测方法
观察术后2周、3个月实验动物关节活动、双侧步态、有无溃疡形成。肌电图仪(丹麦)检测术后2周及3个月运动神经元动作电位潜伏期(Lat)、波幅(Amp)和传导速度(CV)。术后2周及3个月以桥接体中部为标志，取材、包埋，行HE染色、Cajar吡啶银染色、免疫组化SP法显示MBP，并采用图像分析仪测量神经纤维面积、密度、直径及轴突直径。
, 百拇医药
结果
一、一般观察
两组动物均出现患足肿胀，足跟溃疡，实验组较轻，愈合时间较早。3个月后实验组动物步态较为协调，3只实验兔出现蹦跳现象。
二、电生理检查
术后2周实验组和对照组均无动作电位产生，3个月后，两组经统计学分析LAT差异无显著性意义，而CV和Amp差异有显著性意义(表1)。
表1 术后3个月电生理结果 组别
例数(n)
Lat(ms)
Amp(mV)
CV(m/s)
, 百拇医药
对照组
9
2.72±0.59
2.77±1.89
16.99±3.61
实验组
9
3.12±0.51
5.68±3.05
23.30±2.91
t值
-
1.54
, 百拇医药
2.85
2.207
P值
-
>0.05
<0.05
<0.05
三、组织学检查
术后2周HE染色见桥接体成分外还伴有少量炎细胞浸润。3个月对照组可见基底膜物质残留，见新生神经纤维增生，部分已成线团状，偶见新生有髓纤维(图1)。实验组，基底膜基本被吸收，可见较多再生神经纤维，以有髓纤维为主，并见无髓神经纤维(图2)。通过病理学分析，实验组神经组织的修复质量明显好于对照组(表2)。
, 百拇医药
图1 可见残留基底膜物质，周围有再生的神经纤维×100
图2 移植段被再生神经纤维取代，基底膜基本被吸收×100
表2 术后3个月组织学结果 组别
例数(n)
神经面积(mm2)
神经纤维密度(mm2)
神经纤维直径(μm)
轴突直径(μm)
对照组
, 百拇医药
9
0.97±0.22
94.83±11.36
5.44±1.29
1.16±0.85
实验组
9
0.94±0.21
93.56±10.27
6.69±1.89
2.52±0.97
t值
, http://www.100md.com
-
0.84
0.24
1.64
2.166
P值
-
>0.05
>0.05
>0.05
<0.05
讨论
Stockel等[3]和Santos等[4]认为运动神经元不能逆行运输NGF，基本否定了外源性NGF促进神经再生的作用。国内有的学者研究显示，外源性NGF对运动神经元和感觉神经元轴突的再生均无明显促进作用[5]。为探讨这一问题，我们选用成年动物，切断兔坐骨神经造成15mm缺损，给予外源性NGF观察术后3个月，并对多项指标客观评价。实验表明：一般情况恢复实验组明显好于对照组(如前所述)。两组CV和Amp比较差异有显著性意义(t=2.207,P<0.05;t=2.853,P<0.05)。经统计学分析神经面积、神经纤维密度、神经纤维直径，两组比较差异无显著性意义。但轴突直径差异有显著性意义(t="2.166,P<"0.05)。实验组镜下可见有序的神经小束形成，整个内部结构比较成熟，细胞修复质量优于对照组。尤其实验组3只兔出现蹦跳现象。提示有较粗的、有效的运动神经纤维已通过桥接体并作用到效应器。此结果与CV、轴突直径实验组优于对照组的结果相吻合。我们认为，在桥接体修复神经损伤过程中再生神经纤维的密度、面积不是主要的，更为重要的是是否有高质量、有效的运动神经纤维通过桥接体。
, http://www.100md.com
选用静脉作为再生的神经轴突跨越缺损部位的桥梁，与其他材料相比优势突出。3个月后桥接体外观的颜色、弹性、直径、光滑度、塌陷情况，两组比较无明显区别，已近似正常神经组织，但实验组镜下细胞修复质量优于对照组(图3)。静脉具有一定通透性，利于营养物质渗透和局部循环重建，对维系神经缺损后所构建的微环境起着重要的作用，选择具有生物活性的基底膜作为静脉内的填充材料，均符合神经损伤修复的要求。两者来源广泛，基本无排斥反应，是一种周围神经损伤修复较为理想的、实用的生物材料。
图3 术后3个月,对照组神经连接良好，无神经瘤形成(a)，实验组神经连接良好，外观接近正常神经组织，表面有新生血管形成(b)
本研究揭示，周围神经损伤后，于神经损伤部位给予外源性NGF对防止神经的变性和促进再生是有益的。外源性NGF可能被相应的胞体和轴突利用通过损伤轴突逆行运输到达胞体，经过复杂的细胞代谢过程，促进轴突的延长和髓鞘化。本研究结果与前面学者的见解相悖[3],与一些学者的研究观点相似[6,7]。
, 百拇医药
参考文献
1，蒋立新，钟世镇.周围神经损伤修复机理的研究进展.中华手外科杂志,1997,13:55-57.
2，罗永湘，方煌，庞清江，等.神经生长因子对周围运动纤维再生的影响.中华手外科杂志，1997,13:3-5.
3，Stockel K,Schwab M,Thoenen H. Comparison between the retrograde axonal transport of nerve growth factor and tetanus toxin in motor,sensory and adrenergic neurons. Brain Res,1975,99:1- 16.
4，Santos PM,Winterowd JG,Allen GG, et al. Nerve growth factor:increased angiogenesis without improved nerve regeneration. Otolaryngol Head Neck Surg,1991,105:12- 25.
, http://www.100md.com
5，许家军，何成.睫状神经营养因子神经生长因子对周围神经再生的作用.中华手外科杂志，1997,13:16-18.
6，庞清江，罗永湘，房清敏.神经生长因子对脊髓前角运动神经元的保护作用.中华手外科杂志，1997,13:19-21.
7，Cheng B,McMahon DG, Mattson MP. Modulation of calcium current, intracellular calcium levels and cell survival by glucose deprivation and growth factors in hippocampal neurons. Brain Res,1993,607:275- 285.
(收稿日期：1999-05-17), 百拇医药
单位：赵凤仪(300211 天津医院骨研所)；周佩兰 孔令震(300211 天津医院骨研所手外科)；赵卫生(300211 天津医院骨研所肌电图室)；王瑞林(300211 天津医院骨研所病理科)；杨明富 张铁良(300211 天津医院骨研 所创伤科)
关键词：
中华骨科杂志000116
躯体运动神经元对NGF是否具有应答能力至今尚缺乏直接证据[1,2]，我们采用自体静脉+基底膜+NGF桥接兔坐骨神经15mm缺损，探讨外源性NGF对运动神经元再生的促进作用。
材料与方法
一、实验动物分组与桥接体制备
, http://www.100md.com
健康兔24只，重约2.0～2.5kg。随机分为实验组(静脉+基底膜+NGF)和对照组(静脉+基底膜+NS)。每组12只。取自体臀外静脉，长度25～30mm。基底膜取顺产胎儿羊膜，洗涤，去上皮细胞，修剪，备用。NGF(1000u/ml)由军事科学院第三研究所提供。
二、手术方法
兔耳缘静脉麻醉，显露右侧坐骨神经，切断造成15mm缺损，植入桥接体用静脉套接法吻合。
四、检测方法
观察术后2周、3个月实验动物关节活动、双侧步态、有无溃疡形成。肌电图仪(丹麦)检测术后2周及3个月运动神经元动作电位潜伏期(Lat)、波幅(Amp)和传导速度(CV)。术后2周及3个月以桥接体中部为标志，取材、包埋，行HE染色、Cajar吡啶银染色、免疫组化SP法显示MBP，并采用图像分析仪测量神经纤维面积、密度、直径及轴突直径。
, 百拇医药
结果
一、一般观察
两组动物均出现患足肿胀，足跟溃疡，实验组较轻，愈合时间较早。3个月后实验组动物步态较为协调，3只实验兔出现蹦跳现象。
二、电生理检查
术后2周实验组和对照组均无动作电位产生，3个月后，两组经统计学分析LAT差异无显著性意义，而CV和Amp差异有显著性意义(表1)。
表1 术后3个月电生理结果 组别
例数(n)
Lat(ms)
Amp(mV)
CV(m/s)
, 百拇医药
对照组
9
2.72±0.59
2.77±1.89
16.99±3.61
实验组
9
3.12±0.51
5.68±3.05
23.30±2.91
t值
-
1.54
, 百拇医药
2.85
2.207
P值
-
>0.05
<0.05
<0.05
三、组织学检查
术后2周HE染色见桥接体成分外还伴有少量炎细胞浸润。3个月对照组可见基底膜物质残留，见新生神经纤维增生，部分已成线团状，偶见新生有髓纤维(图1)。实验组，基底膜基本被吸收，可见较多再生神经纤维，以有髓纤维为主，并见无髓神经纤维(图2)。通过病理学分析，实验组神经组织的修复质量明显好于对照组(表2)。
, 百拇医药
图1 可见残留基底膜物质，周围有再生的神经纤维×100
图2 移植段被再生神经纤维取代，基底膜基本被吸收×100
表2 术后3个月组织学结果 组别
例数(n)
神经面积(mm2)
神经纤维密度(mm2)
神经纤维直径(μm)
轴突直径(μm)
对照组
, 百拇医药
9
0.97±0.22
94.83±11.36
5.44±1.29
1.16±0.85
实验组
9
0.94±0.21
93.56±10.27
6.69±1.89
2.52±0.97
t值
, http://www.100md.com
-
0.84
0.24
1.64
2.166
P值
-
>0.05
>0.05
>0.05
<0.05
讨论
Stockel等[3]和Santos等[4]认为运动神经元不能逆行运输NGF，基本否定了外源性NGF促进神经再生的作用。国内有的学者研究显示，外源性NGF对运动神经元和感觉神经元轴突的再生均无明显促进作用[5]。为探讨这一问题，我们选用成年动物，切断兔坐骨神经造成15mm缺损，给予外源性NGF观察术后3个月，并对多项指标客观评价。实验表明：一般情况恢复实验组明显好于对照组(如前所述)。两组CV和Amp比较差异有显著性意义(t=2.207,P<0.05;t=2.853,P<0.05)。经统计学分析神经面积、神经纤维密度、神经纤维直径，两组比较差异无显著性意义。但轴突直径差异有显著性意义(t="2.166,P<"0.05)。实验组镜下可见有序的神经小束形成，整个内部结构比较成熟，细胞修复质量优于对照组。尤其实验组3只兔出现蹦跳现象。提示有较粗的、有效的运动神经纤维已通过桥接体并作用到效应器。此结果与CV、轴突直径实验组优于对照组的结果相吻合。我们认为，在桥接体修复神经损伤过程中再生神经纤维的密度、面积不是主要的，更为重要的是是否有高质量、有效的运动神经纤维通过桥接体。
, http://www.100md.com
选用静脉作为再生的神经轴突跨越缺损部位的桥梁，与其他材料相比优势突出。3个月后桥接体外观的颜色、弹性、直径、光滑度、塌陷情况，两组比较无明显区别，已近似正常神经组织，但实验组镜下细胞修复质量优于对照组(图3)。静脉具有一定通透性，利于营养物质渗透和局部循环重建，对维系神经缺损后所构建的微环境起着重要的作用，选择具有生物活性的基底膜作为静脉内的填充材料，均符合神经损伤修复的要求。两者来源广泛，基本无排斥反应，是一种周围神经损伤修复较为理想的、实用的生物材料。
图3 术后3个月,对照组神经连接良好，无神经瘤形成(a)，实验组神经连接良好，外观接近正常神经组织，表面有新生血管形成(b)
本研究揭示，周围神经损伤后，于神经损伤部位给予外源性NGF对防止神经的变性和促进再生是有益的。外源性NGF可能被相应的胞体和轴突利用通过损伤轴突逆行运输到达胞体，经过复杂的细胞代谢过程，促进轴突的延长和髓鞘化。本研究结果与前面学者的见解相悖[3],与一些学者的研究观点相似[6,7]。
, 百拇医药
参考文献
1，蒋立新，钟世镇.周围神经损伤修复机理的研究进展.中华手外科杂志,1997,13:55-57.
2，罗永湘，方煌，庞清江，等.神经生长因子对周围运动纤维再生的影响.中华手外科杂志，1997,13:3-5.
3，Stockel K,Schwab M,Thoenen H. Comparison between the retrograde axonal transport of nerve growth factor and tetanus toxin in motor,sensory and adrenergic neurons. Brain Res,1975,99:1- 16.
4，Santos PM,Winterowd JG,Allen GG, et al. Nerve growth factor:increased angiogenesis without improved nerve regeneration. Otolaryngol Head Neck Surg,1991,105:12- 25.
, http://www.100md.com
5，许家军，何成.睫状神经营养因子神经生长因子对周围神经再生的作用.中华手外科杂志，1997,13:16-18.
6，庞清江，罗永湘，房清敏.神经生长因子对脊髓前角运动神经元的保护作用.中华手外科杂志，1997,13:19-21.
7，Cheng B,McMahon DG, Mattson MP. Modulation of calcium current, intracellular calcium levels and cell survival by glucose deprivation and growth factors in hippocampal neurons. Brain Res,1993,607:275- 285.
(收稿日期：1999-05-17), 百拇医药