糖尿病微血管病变研究中微循环的应用提高双歧杆菌活菌制剂常温贮存稳定性的实验研究
作者：周佳音 石林华 盛超 郑筱祥
单位：周佳音(310027 浙江省杭州市，浙江大学 玉泉校区 生命科学与医学工程学系)；盛超(310027 浙江省杭州市，浙江大学 玉泉校区 生命科学与医学工程学系)；郑筱祥(310027 浙江省杭州市，浙江大学 玉泉校区 生命科学与医学工程学系)；石林华(浙江省电子技术研究所)
关键词：
中国微循环000123
1 概述
微循环是直接参与组织、细胞物质交换的血液、淋巴液和组织液的流动。随着微循环技术的不断发展，微循环研究已日渐深入地应用于许多疾病的基础研究与临床治疗之中。例如各种创伤、烧伤、辐射损伤、老年性疾病、心脑血管疾病与代谢性疾病等等。研究课题主要涉及流动物质(血液、 淋巴液、 组织液)的理化特性及生物学、流变学在病理条件下的变化； 流动管道(微血管壁，毛细淋巴管壁及组织间隙)的结构、功能、代谢特点在病理条件下的改变；流动物质和流动管道的相互作用(主要体现在内皮细胞)，管道和其周围组织的相互关系的变化； 药物对微循环的影响[1]。
, 百拇医药
糖尿病(DM)是一种严重威胁人类健康的代谢性疾病，许多并发症如高血压、视网膜病变(DR)、肾病、皮肤病等给患者带来很大的痛苦与较高的死亡率，且现在的发病率不断升高，平均发病年龄不断降低。研究认为，DM时的很多异常以不同的机制影响血液流变性、微血管和间隙组织的特性导致靶器官机能障碍，进而导致各种慢性并发症。其中最明显的是微血管病变，它是DM慢性并发症的病理基础，而微循环的改变对微血管病变的发生有重要影响。一般认为，形态学上的变化包括毛细血管增殖与退化，毛细血管基底膜的增厚；生理学的变化有毛细血管通透性(MCP)的增加，毛细血管内皮间氧弥散的减少等；流变学的变化包括各种血细胞形态上的变化，血流的改变与血管内外壁切向应力的改变。采用微循环的技术与方法，对DM及其相关疾病的研究已成为热点。
2 流动物质(血液、淋巴液、组织液)的理化特性及其生物学、流变学在糖尿病条件下的变化
通过对甲襞毛细血管的观察，DM患者与健康人相比，管襻的清晰度、排列，血流速度及血流状态、管壁张力均有显著的异常：表现在DM组的毛细血管管襻显现不清，排列紊乱，血流缓慢(多呈粒线流或粒流且管襻瘀血明显)，管襻张力差，同时异形管襻增多，输入支与输出支的比例差异明显，提示DM患者的微血管存在痉挛及输出支扩张状态。另外，DM组有较多的管襻出血，渗出，红细胞聚集的现象。相应的动物体表微循环形态学上的测量也证明了这一点。拓西平等应用激光多普勒血流仪短期动态观察DM患者的足背微区血流，发现DM患者下肢皮肤血流只有72.2%的微区呈现高、低灌流相灌注，明显低于对照组(100%)，且灌注持续时间及两相上升和下降时间明显长于对照组，提示由于DM患者下肢皮肤微血管病变导致代偿性血流供应增加所致[2]。Zaugg Vesti BR等应用红外荧光视频显微技术研究表明Ⅰ型DM病人不论是否有DR，其皮肤微动脉瘤的发生比例显著高于正常对照组，并认为皮肤微动脉瘤是DM微血管病变的一个重要的形态学特征[3]。血液流变学的研究表明，与对照组相比，DM组全血各粘度指标，红细胞刚性指数(IR)明显升高，红细胞电泳率(EMR)明显降低，血小板粘附性增高，聚集性增强，释放反应异常[1，4]。陈铭声等用放射免疫法测定111例男性DM并发微血管病变患者的血清性激素的水平，发现血清T含量明显低于正常对照组，E2含量明显高于正常对照组，提示E2/T比值增高可能导致男性DM并发微血管病变[5]。
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以上这些结论都体现出DM能通过血液理化及流变性的改变影响微循环的有效灌注，并认为这是形成并发症的一个重要因素。而微循环有效灌注的改变正是MCP、血管内皮的异常在宏观上的体现。
3 流动管道(微血管壁，毛细淋巴管壁及组织间隙)的结构、功能、代谢特点在糖尿病条件下的改变
研究表明，动物模型出现DM时，胰腺的微循环已有了变化。使用微循环显微镜对链脲佐菌素(STZ)所致DM模型大鼠进行活体胰腺微循环观察发现：胰岛毛细血管排列失去丝秋状构型，毛细血管数减少，走行紊乱，微血管管径变细，凹凸不平，并有不同程度的出血。Enghofer M等应用体内荧光显微技术观察注射STZ后大鼠胰岛微循环状况，发现注射STZ1h后MCP增加，3h后胰岛血流速度显著降低，提示STZ造成严重的胰岛微循环紊乱[6]。
除胰腺外，在DM发病早期，小动脉对5-HT的收缩性和小静脉对5-HT表现出来的通透性均有明显改变，同时改变促效药(组织胺等)所诱发的MCP。这种情况在基底小动脉是否有紧张性的条件下有很大差别。Sorokin EL等应用荧光测定术观测了79个不同阶段的DR病人的血-视网膜屏障，发现随着DR的发展，血管到视网膜方向上的通透性增加而从视网膜到血管的流出液体量减少[7]。李才等应用阳离子铁蛋白电镜示踪法研究了大鼠不同DM阶段心肌MCP改变与基底膜之间的关系，发现大鼠实验性DM发生后不同时期，MCP均明显增大，且随病程延长更趋明显。这引起血浆成分漏入心肌间质，阻碍了血液与心肌细胞之间的物质交换，尤其增加了氧弥散的距离。研究还发现，糖尿病七个月以上的大鼠心肌细胞基底膜上的铁蛋白颗粒明显少于对照组，且随着病程的延长而逐渐减少。提示DM晚期微血管基底膜负电荷下降，减弱基底膜的屏障作用，可能是DM时MCP增大的原因之一[8]。刘松岩等应用辣根过氧化物酶(HRP)示踪法研究STZ所致8周实验性DM大鼠心肌细胞膜通透性的变化，结果表明，DM大鼠心肌中HRP阳性肌细胞数明显多于对照组，提示DM大鼠心肌细胞膜通透性明显增大，这种异常的增大在DM性心肌病中可能起重要作用[9]。
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从以上一些实验结果可以发现，在组织水平，DM所致的很多并发症与MCP的异常变动有很大的关系，而MCP的异常变动又和内皮的异常情况直接相关。
4 流动物质和流动管道的相互作用(主要体现在内皮细胞)、管道和其周围组织的相互关系在糖尿病条件下的变化
实验证明，DM可以剧烈地改变毛细血管基底膜的特性与内皮细胞的作用，包括增厚基底膜、影响血管通透性、影响对组织生长的控制、 改变止血反应和血管舒缩的调节等，导致并发症的产生。近年来由于新技术、新方法的应用，出现了一批新的研究结果。
Tooke JE等研究表明，在Ⅰ型DM中，毛细血管压对微血管功能异常起主要作用，而在Ⅱ型DM中，一氧化氮通路紊乱所致的内皮异常对微血管功能异常起重要作用，对微血管内皮的复合损伤可导致微血管适应性硬化，收舒性与自调节功能的丧失[10]。Lin SJ等采用荧光显微技术，以伊文思蓝—白蛋白复合物为标记物，证明了STZ致DM大鼠主动脉内皮细胞的更新(turnover)和与此相关的内皮对大分子物质通透性的增加。采用间接免疫超氧化物法，他们还发现STZ致DM大鼠主动脉内皮细胞的死亡率明显高于控制组[11]。Mc Minn LH等采用外荧光—共聚焦激光扫描显微技术，观察了荧光标记的聚苯乙烯乳胶微粒在STZ致DM动物小肠中的摄取与易位的情况，结果表明在上皮与非上皮组织腔隙中，与对照组相比，微粒的易位与末梢吸收减少了30%，提示可能与DM致的通透性改变有关[12]。Papaccio G发现，用低剂量STZ处理的动物能在环绕胰岛的后毛细血管水平诱发单核细胞与巨噬细胞的激活、毛细血管的变化、伴发性的超氧化岐化酶(SOD)的作用的降低。再加上观察到MCP的增加与胰岛水肿形成，认为可以用“微血管系统(microvascular)”的方法来研究这类疾病[13]。De Paepe ME等应用高分辨率蛋白A胶体金免疫细胞化学法，以内皮白蛋白作为内皮完整性的标志物，研究自发性DM大鼠，发现在DM初始时期，有一选择性的胰岛MCP的增加，并认为这是一种研究胰腺微血管系统的有效的方法[14]。
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对上述的内皮异常情况较一致的看法是，由于微循环有效灌注的异常，同时红细胞聚集体解聚切变应力增大，糖化终产物形成过程中大量自由基的生成以及高血脂状态下白细胞粘附性的增强等均能造成血管内皮细胞和血管壁的损伤而诱发微血管病变。
5 化学物质在糖尿病的条件下对微循环障碍的保护作用
研究表明许多化学物质有保护内皮、抑制DM条件下的MCP增加的作用。例如E系列前列腺素、Cyclo 3 Fort、中性肽链内断酶等。近来对类黄酮的化合物(一种肾素—血管紧张素酶的抑制剂)的报道相当多，而临床研究表明类黄酮的化合物并不具备降血糖的作用。Bertuglia S等应用荧光显微技术观察了注射四氧嘧啶(alloxan)90d后DM田鼠颊囊微循环的情况，测定了小静脉壁的通透性、白细胞对小静脉壁的粘附数、血管对乙酰胆碱(Ach)和硝普盐钠(SNP)的舒张反射。结果表明，MCP与白细胞对小静脉内皮的粘附数都有增加，这些结果可能与DM动物小动脉松驰性降低和平滑肌细胞功能丧失有关。他们发现，类黄酮花翠素的氯化物对上述结果有抑制作用，提示黄酮类花翠素的氯化物能阻止DM状态下内皮细胞功能的损伤[15]。Wadworth AN等研究证明，羟乙胺路丁(hydroxyethylrut _osides),一种半合成类黄酮的标准化混合物，能作用于毛细血管内皮，改善微血管灌流与微循环，降低DR患者的视网膜MCP[16]。Valensi PE等应用体外γ照相机，测量了锝标记的白蛋白在DM患者毛细血管中的滤过作用，发现经纯化的类黄酮分馏物能显著地降低这种作用，同时他们还发现这种物质能显著降低DM致水肿患者的MCP与细胞内液的外流量[17]。Bouskela等也以右旋糖酐为荧光标记物，观测发现类黄酮分馏物对DM田鼠，由组织胺、血管缓激肽、白细胞三烯诱发的大分子通透性激增有明显的抑制作用，并对DM田鼠的缺血—再灌注引起白细胞对血管内皮的粘附现象有抑制作用[18]。
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6 总结与展望
近些年来研究人员从不同角度采用微循环的技术与方法对DM进行的研究取得了一定的进展，得到不少有价值的信息。主要表现在：
6.1 方法学的不断进步
激光多普勒血流参数测量，荧光显微—标记物技术对MCP和物质在血管与组织间的交换的观测，共聚焦显微镜对毛细血管内外膜的三维结构的观察等已广泛应用于研究之中。尤其是近年来，由于内皮细胞培养技术的发展，利用荧光标记、放免、酶标、电镜组织化学等先进技术，进行了病理条件下微循环代谢方面的研究。
6.2 研究层次的不断深入
随着研究手段的进步，研究层次从最初的整体、器官水平，跨越到现在的组织与细胞水平；从以定性的指标说明问题，跨越到初步以定量的指标来说明，尤其是对于内皮细胞的研究，使我们能从机理上更深入地了解微血管病变的过程(高血糖引起基底膜中葡萄糖苷转移酶活力增加→基底膜变化→特定毛细血管床上的通透性的改变→细胞与间隙之间组织肿胀→细胞物质输运的紊乱→靶器官损伤)，不仅研究了DM后微血管与内皮的变化情况，还研究了DM形成中与形成前的情况。有的学者提出，在DM症状形成前，已经有组织水平的病变存在。
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但是，迄今为止对DM及并发症形成机理上学者们尚未形成一致的看法，许多问题无法给予确切的回答。在对已有的研究结果进行分析时，不难发现其中有一些差异与矛盾。其中有所用模型与测试手段不同而带来差异，另一方面，不同学者在研究时的侧重点不同也使对问题的认识有分歧。如Fitzgerald ME等的实验结果提示在DM大鼠视网膜微血管中，MCP与腔膜阴离子电荷(luminal membrance anionic charge)都保持正常[19]。Mayhan WG采用体内荧光显微技术，研究DM大鼠血脑屏障的通透性在高血压下的变化，结果提示血脑屏障的通透性与控制组相比并没有显著改变[20]。这与本文3、4部分所引的很多结论不符。值得注意的是在各个有关血管、血流、通透、内皮的指标中，定量的不多，有也是一些比较粗略的指标。如在测定血管、内皮通透性中，大多采用白蛋白清除率(clearance)和血管泄漏点数(number of microvascular leaky sites)，在实验中误差较大且操作复杂。另外，很多方法仅静态地反映血管组织病变的情况，不能显示其动态的过程，而病变动态过程可能是很有意义的。因此提出一套与临床相结合，快速、定量、准确的动态参数测试方法是很有意义的[21]。
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使用微循环的技术也是对DM的治疗过程与疗效评价的一个重要方法[22]。引起DM微血管病变的因素有很多方面，最主要的是体内代谢紊乱而造成的血管与血液特性的改变。因此除了积极有效地控制血糖，纠正代谢异常外，采用改善微循环，纠正血液流变学异常的治疗方法(中医称为活血化瘀)具有积极意义。本文第五部分所引的很多材料都指出了肾素—血管紧张素酶的抑制剂对于DM微血管损伤与通透性紊乱的改善作用。因此微循环技术作为一种药理上的工具是可行的，其在DM治疗与预防药物筛选中的作用是不容忽视的。
参考文献
1，田牛主编微循环基础与临床.北京：人民军医出版社1986，前言
2，拓西平，孟庆春，叶绍彦，等糖尿病患者指腹及足背区血流量的观察第二军医大学学报1995，16(4)：370
3，Zaugg Vseti BR, Franzeck UK， Vou Ziegler C, et al. Skin capillary aneurysms detected by indocyanine green in type I diabetes with and without retinal microaneurysms.Int J Microcirc Clin Exp.1995,15(4):193
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4，杨景旭，童光焕，张周良糖尿病患者血液流变学与甲襞微循环之间的关系第四军医大学学报1995，16(6)：423
5，陈铭声，于文彬，姬秋和，等男性糖尿病血清激素与微血管病变关系的研究陕西医学杂志1995，24(10)：592
6，Enghofer M, Usadl KH, Beck O, et al. Superoxide dismutase reduces islet microvascular injury induced by streptozotocin in the rat. Am J Physiol.1995,273(2Pt 1):E376
7，Sorokin EL,Smoliakova GP.Structral and functional disorders of transcapillary metabolism of retina in patients with diabetic retinopathy. Vestn Oftalmol.1997,113(2)16
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8，李才.糖尿病大鼠心肌毛细血管通透性的研究.中华病理学杂志
1992，21(3)：183
9，刘松岩，李才，王丽娟，等实验性糖尿病大鼠心肌细胞通透性的变化白求恩医科大学学报1992，18(2)：139
10，Tooke JE, Morris SJ, Shore AC, et al. Microvascular functional abnormalities in diabetes: the role of the endothelium.Diabetes Res Clin Pract.1996,31 Suppl:S127
11，Lin SJ,Hong CY,Chang MS, et al. Effects of hyperlipidemia on aortic endothelial cell turnover and transendothelial macromolecular transport in cholesterol_fed rats.Chung Hua I Hsueh Tsa China Taipei.1996,58(4):235
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12，McMinn LH,Hodges GM,Carr KE, et al. Gastrointestinal uptake and translocation of microparticles in the streptozotocin-diabetic rat.J Anat.1996,189(Pt3):553
13，Papaccio G. Insulitis and islet microvasculature in type I diabetes. Histstol Histopaol. 1993,8(4):751
14，De Paepe ME, Corrivean M, Tannous WN, et al. Increased vascular permeabbility in pancreas of diabetic rats: detction with high resolution protein A-gold cytochemistry. Diabetologia. 1992,35(12):1118
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15，Bertuglia S, Malandrino S, Colantuoni A. Effects of the natural flavonoid delphiinndin on diabetic microangiopathy. Arzneimittelforschung. 1995,45(4):481
16，Wadworth AN,Faulds D. Hydroxyethylrutosides. A review of its pharmacology, and therapeutic efficacy in venous insufficiency and related disorders. Drugs.1992,44(6):1013
17，Valensi PE, Behar A, De Champvallins MM, et al. Effects of a purified micronized flavonoid fraction on capillary filtration in diabetic patients. Diabet Med. 1996,13(10):882
, 百拇医药
18，Bouskela E, Cyrino FZ, Conde CM, et al. Effects of oral administratin of purified micronized flavonoid fraction on increased microvascular permeability induced by various agents and on ischemia/reperfusion indiabetic hamsters. Int J Microcirc Clin Exp.1995,15(6):293
19，Fitzgerald ME, Caldwell RB. The retinal microvasculature of spontaneously diabetic BB rats: structure and luminal surface properties. Microvasc Res. 1990,39(1):15
, 百拇医药
20，Mayhan WC. Effects of diabetes mellitus on disruption of the blood _brain barrier during acute hypertension. Brain Res. 1990,26;534(1 _ 2):106
21，郑筱祥，许雷，张恒义.原发性高血压眼底血管形态与光学特性改变的定量分析结果及临床意义中华物理医学杂志1997，19(3)：159
22，Fagrell B. Advances in microcirculation network evaluation:an update. Int J Microciro Clin Exp.1995,15 Suppl 1:34
(收稿：1998-12-21修回：1999-05-10)
中国微生态学杂志 2000年第3期第12卷 丽珠专栏
提高双歧杆菌活菌制剂常温贮存稳定性的实验研究
作者：李丽华 杨章汉 雍学安 刘敏 钟群容
单位：珠海丽珠集团丽珠生物工程制药厂，广东 珠海 519000
关键词：双歧杆菌活菌制剂；常温贮存；稳定性., http://www.100md.com
单位：周佳音(310027 浙江省杭州市，浙江大学 玉泉校区 生命科学与医学工程学系)；盛超(310027 浙江省杭州市，浙江大学 玉泉校区 生命科学与医学工程学系)；郑筱祥(310027 浙江省杭州市，浙江大学 玉泉校区 生命科学与医学工程学系)；石林华(浙江省电子技术研究所)
关键词：
中国微循环000123
1 概述
微循环是直接参与组织、细胞物质交换的血液、淋巴液和组织液的流动。随着微循环技术的不断发展，微循环研究已日渐深入地应用于许多疾病的基础研究与临床治疗之中。例如各种创伤、烧伤、辐射损伤、老年性疾病、心脑血管疾病与代谢性疾病等等。研究课题主要涉及流动物质(血液、 淋巴液、 组织液)的理化特性及生物学、流变学在病理条件下的变化； 流动管道(微血管壁，毛细淋巴管壁及组织间隙)的结构、功能、代谢特点在病理条件下的改变；流动物质和流动管道的相互作用(主要体现在内皮细胞)，管道和其周围组织的相互关系的变化； 药物对微循环的影响[1]。
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糖尿病(DM)是一种严重威胁人类健康的代谢性疾病，许多并发症如高血压、视网膜病变(DR)、肾病、皮肤病等给患者带来很大的痛苦与较高的死亡率，且现在的发病率不断升高，平均发病年龄不断降低。研究认为，DM时的很多异常以不同的机制影响血液流变性、微血管和间隙组织的特性导致靶器官机能障碍，进而导致各种慢性并发症。其中最明显的是微血管病变，它是DM慢性并发症的病理基础，而微循环的改变对微血管病变的发生有重要影响。一般认为，形态学上的变化包括毛细血管增殖与退化，毛细血管基底膜的增厚；生理学的变化有毛细血管通透性(MCP)的增加，毛细血管内皮间氧弥散的减少等；流变学的变化包括各种血细胞形态上的变化，血流的改变与血管内外壁切向应力的改变。采用微循环的技术与方法，对DM及其相关疾病的研究已成为热点。
2 流动物质(血液、淋巴液、组织液)的理化特性及其生物学、流变学在糖尿病条件下的变化
通过对甲襞毛细血管的观察，DM患者与健康人相比，管襻的清晰度、排列，血流速度及血流状态、管壁张力均有显著的异常：表现在DM组的毛细血管管襻显现不清，排列紊乱，血流缓慢(多呈粒线流或粒流且管襻瘀血明显)，管襻张力差，同时异形管襻增多，输入支与输出支的比例差异明显，提示DM患者的微血管存在痉挛及输出支扩张状态。另外，DM组有较多的管襻出血，渗出，红细胞聚集的现象。相应的动物体表微循环形态学上的测量也证明了这一点。拓西平等应用激光多普勒血流仪短期动态观察DM患者的足背微区血流，发现DM患者下肢皮肤血流只有72.2%的微区呈现高、低灌流相灌注，明显低于对照组(100%)，且灌注持续时间及两相上升和下降时间明显长于对照组，提示由于DM患者下肢皮肤微血管病变导致代偿性血流供应增加所致[2]。Zaugg Vesti BR等应用红外荧光视频显微技术研究表明Ⅰ型DM病人不论是否有DR，其皮肤微动脉瘤的发生比例显著高于正常对照组，并认为皮肤微动脉瘤是DM微血管病变的一个重要的形态学特征[3]。血液流变学的研究表明，与对照组相比，DM组全血各粘度指标，红细胞刚性指数(IR)明显升高，红细胞电泳率(EMR)明显降低，血小板粘附性增高，聚集性增强，释放反应异常[1，4]。陈铭声等用放射免疫法测定111例男性DM并发微血管病变患者的血清性激素的水平，发现血清T含量明显低于正常对照组，E2含量明显高于正常对照组，提示E2/T比值增高可能导致男性DM并发微血管病变[5]。
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以上这些结论都体现出DM能通过血液理化及流变性的改变影响微循环的有效灌注，并认为这是形成并发症的一个重要因素。而微循环有效灌注的改变正是MCP、血管内皮的异常在宏观上的体现。
3 流动管道(微血管壁，毛细淋巴管壁及组织间隙)的结构、功能、代谢特点在糖尿病条件下的改变
研究表明，动物模型出现DM时，胰腺的微循环已有了变化。使用微循环显微镜对链脲佐菌素(STZ)所致DM模型大鼠进行活体胰腺微循环观察发现：胰岛毛细血管排列失去丝秋状构型，毛细血管数减少，走行紊乱，微血管管径变细，凹凸不平，并有不同程度的出血。Enghofer M等应用体内荧光显微技术观察注射STZ后大鼠胰岛微循环状况，发现注射STZ1h后MCP增加，3h后胰岛血流速度显著降低，提示STZ造成严重的胰岛微循环紊乱[6]。
除胰腺外，在DM发病早期，小动脉对5-HT的收缩性和小静脉对5-HT表现出来的通透性均有明显改变，同时改变促效药(组织胺等)所诱发的MCP。这种情况在基底小动脉是否有紧张性的条件下有很大差别。Sorokin EL等应用荧光测定术观测了79个不同阶段的DR病人的血-视网膜屏障，发现随着DR的发展，血管到视网膜方向上的通透性增加而从视网膜到血管的流出液体量减少[7]。李才等应用阳离子铁蛋白电镜示踪法研究了大鼠不同DM阶段心肌MCP改变与基底膜之间的关系，发现大鼠实验性DM发生后不同时期，MCP均明显增大，且随病程延长更趋明显。这引起血浆成分漏入心肌间质，阻碍了血液与心肌细胞之间的物质交换，尤其增加了氧弥散的距离。研究还发现，糖尿病七个月以上的大鼠心肌细胞基底膜上的铁蛋白颗粒明显少于对照组，且随着病程的延长而逐渐减少。提示DM晚期微血管基底膜负电荷下降，减弱基底膜的屏障作用，可能是DM时MCP增大的原因之一[8]。刘松岩等应用辣根过氧化物酶(HRP)示踪法研究STZ所致8周实验性DM大鼠心肌细胞膜通透性的变化，结果表明，DM大鼠心肌中HRP阳性肌细胞数明显多于对照组，提示DM大鼠心肌细胞膜通透性明显增大，这种异常的增大在DM性心肌病中可能起重要作用[9]。
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从以上一些实验结果可以发现，在组织水平，DM所致的很多并发症与MCP的异常变动有很大的关系，而MCP的异常变动又和内皮的异常情况直接相关。
4 流动物质和流动管道的相互作用(主要体现在内皮细胞)、管道和其周围组织的相互关系在糖尿病条件下的变化
实验证明，DM可以剧烈地改变毛细血管基底膜的特性与内皮细胞的作用，包括增厚基底膜、影响血管通透性、影响对组织生长的控制、 改变止血反应和血管舒缩的调节等，导致并发症的产生。近年来由于新技术、新方法的应用，出现了一批新的研究结果。
Tooke JE等研究表明，在Ⅰ型DM中，毛细血管压对微血管功能异常起主要作用，而在Ⅱ型DM中，一氧化氮通路紊乱所致的内皮异常对微血管功能异常起重要作用，对微血管内皮的复合损伤可导致微血管适应性硬化，收舒性与自调节功能的丧失[10]。Lin SJ等采用荧光显微技术，以伊文思蓝—白蛋白复合物为标记物，证明了STZ致DM大鼠主动脉内皮细胞的更新(turnover)和与此相关的内皮对大分子物质通透性的增加。采用间接免疫超氧化物法，他们还发现STZ致DM大鼠主动脉内皮细胞的死亡率明显高于控制组[11]。Mc Minn LH等采用外荧光—共聚焦激光扫描显微技术，观察了荧光标记的聚苯乙烯乳胶微粒在STZ致DM动物小肠中的摄取与易位的情况，结果表明在上皮与非上皮组织腔隙中，与对照组相比，微粒的易位与末梢吸收减少了30%，提示可能与DM致的通透性改变有关[12]。Papaccio G发现，用低剂量STZ处理的动物能在环绕胰岛的后毛细血管水平诱发单核细胞与巨噬细胞的激活、毛细血管的变化、伴发性的超氧化岐化酶(SOD)的作用的降低。再加上观察到MCP的增加与胰岛水肿形成，认为可以用“微血管系统(microvascular)”的方法来研究这类疾病[13]。De Paepe ME等应用高分辨率蛋白A胶体金免疫细胞化学法，以内皮白蛋白作为内皮完整性的标志物，研究自发性DM大鼠，发现在DM初始时期，有一选择性的胰岛MCP的增加，并认为这是一种研究胰腺微血管系统的有效的方法[14]。
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对上述的内皮异常情况较一致的看法是，由于微循环有效灌注的异常，同时红细胞聚集体解聚切变应力增大，糖化终产物形成过程中大量自由基的生成以及高血脂状态下白细胞粘附性的增强等均能造成血管内皮细胞和血管壁的损伤而诱发微血管病变。
5 化学物质在糖尿病的条件下对微循环障碍的保护作用
研究表明许多化学物质有保护内皮、抑制DM条件下的MCP增加的作用。例如E系列前列腺素、Cyclo 3 Fort、中性肽链内断酶等。近来对类黄酮的化合物(一种肾素—血管紧张素酶的抑制剂)的报道相当多，而临床研究表明类黄酮的化合物并不具备降血糖的作用。Bertuglia S等应用荧光显微技术观察了注射四氧嘧啶(alloxan)90d后DM田鼠颊囊微循环的情况，测定了小静脉壁的通透性、白细胞对小静脉壁的粘附数、血管对乙酰胆碱(Ach)和硝普盐钠(SNP)的舒张反射。结果表明，MCP与白细胞对小静脉内皮的粘附数都有增加，这些结果可能与DM动物小动脉松驰性降低和平滑肌细胞功能丧失有关。他们发现，类黄酮花翠素的氯化物对上述结果有抑制作用，提示黄酮类花翠素的氯化物能阻止DM状态下内皮细胞功能的损伤[15]。Wadworth AN等研究证明，羟乙胺路丁(hydroxyethylrut _osides),一种半合成类黄酮的标准化混合物，能作用于毛细血管内皮，改善微血管灌流与微循环，降低DR患者的视网膜MCP[16]。Valensi PE等应用体外γ照相机，测量了锝标记的白蛋白在DM患者毛细血管中的滤过作用，发现经纯化的类黄酮分馏物能显著地降低这种作用，同时他们还发现这种物质能显著降低DM致水肿患者的MCP与细胞内液的外流量[17]。Bouskela等也以右旋糖酐为荧光标记物，观测发现类黄酮分馏物对DM田鼠，由组织胺、血管缓激肽、白细胞三烯诱发的大分子通透性激增有明显的抑制作用，并对DM田鼠的缺血—再灌注引起白细胞对血管内皮的粘附现象有抑制作用[18]。
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6 总结与展望
近些年来研究人员从不同角度采用微循环的技术与方法对DM进行的研究取得了一定的进展，得到不少有价值的信息。主要表现在：
6.1 方法学的不断进步
激光多普勒血流参数测量，荧光显微—标记物技术对MCP和物质在血管与组织间的交换的观测，共聚焦显微镜对毛细血管内外膜的三维结构的观察等已广泛应用于研究之中。尤其是近年来，由于内皮细胞培养技术的发展，利用荧光标记、放免、酶标、电镜组织化学等先进技术，进行了病理条件下微循环代谢方面的研究。
6.2 研究层次的不断深入
随着研究手段的进步，研究层次从最初的整体、器官水平，跨越到现在的组织与细胞水平；从以定性的指标说明问题，跨越到初步以定量的指标来说明，尤其是对于内皮细胞的研究，使我们能从机理上更深入地了解微血管病变的过程(高血糖引起基底膜中葡萄糖苷转移酶活力增加→基底膜变化→特定毛细血管床上的通透性的改变→细胞与间隙之间组织肿胀→细胞物质输运的紊乱→靶器官损伤)，不仅研究了DM后微血管与内皮的变化情况，还研究了DM形成中与形成前的情况。有的学者提出，在DM症状形成前，已经有组织水平的病变存在。
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但是，迄今为止对DM及并发症形成机理上学者们尚未形成一致的看法，许多问题无法给予确切的回答。在对已有的研究结果进行分析时，不难发现其中有一些差异与矛盾。其中有所用模型与测试手段不同而带来差异，另一方面，不同学者在研究时的侧重点不同也使对问题的认识有分歧。如Fitzgerald ME等的实验结果提示在DM大鼠视网膜微血管中，MCP与腔膜阴离子电荷(luminal membrance anionic charge)都保持正常[19]。Mayhan WG采用体内荧光显微技术，研究DM大鼠血脑屏障的通透性在高血压下的变化，结果提示血脑屏障的通透性与控制组相比并没有显著改变[20]。这与本文3、4部分所引的很多结论不符。值得注意的是在各个有关血管、血流、通透、内皮的指标中，定量的不多，有也是一些比较粗略的指标。如在测定血管、内皮通透性中，大多采用白蛋白清除率(clearance)和血管泄漏点数(number of microvascular leaky sites)，在实验中误差较大且操作复杂。另外，很多方法仅静态地反映血管组织病变的情况，不能显示其动态的过程，而病变动态过程可能是很有意义的。因此提出一套与临床相结合，快速、定量、准确的动态参数测试方法是很有意义的[21]。
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使用微循环的技术也是对DM的治疗过程与疗效评价的一个重要方法[22]。引起DM微血管病变的因素有很多方面，最主要的是体内代谢紊乱而造成的血管与血液特性的改变。因此除了积极有效地控制血糖，纠正代谢异常外，采用改善微循环，纠正血液流变学异常的治疗方法(中医称为活血化瘀)具有积极意义。本文第五部分所引的很多材料都指出了肾素—血管紧张素酶的抑制剂对于DM微血管损伤与通透性紊乱的改善作用。因此微循环技术作为一种药理上的工具是可行的，其在DM治疗与预防药物筛选中的作用是不容忽视的。
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(收稿：1998-12-21修回：1999-05-10)
中国微生态学杂志 2000年第3期第12卷 丽珠专栏
提高双歧杆菌活菌制剂常温贮存稳定性的实验研究
作者：李丽华 杨章汉 雍学安 刘敏 钟群容
单位：珠海丽珠集团丽珠生物工程制药厂，广东 珠海 519000
关键词：双歧杆菌活菌制剂；常温贮存；稳定性., http://www.100md.com