一氧化氮对内皮素促心肌细胞肥大及肌球蛋白基因表达的影响
作者：阮长武 戴闺柱 冯宗枕 屈伸
单位：阮长武(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科 武汉，430022 现在上海市长宁中心医院(200336))；戴闺柱(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科 武汉，430022 导师)；冯宗枕(同济医科大学基础医学院生化教研室)；屈伸(同济医科大学基础医学院生化教研室)
关键词：一氧化氮；内皮素；心肌肥大；肌球蛋白重链
临床心血管病杂志000114 摘 要：目的：探讨一氧化氮(NO)对内皮素(ET)促大鼠培养心肌细胞肥大及肌球蛋白重链(MHC)基因表达的影响。方法：对120只大鼠采用心肌细胞培养及斑点杂交的方法，同时测定心肌细胞直径、数目及3H-亮氨酸(3H-Leu)掺入率。结果：NO组、ET组心肌细胞数目与对照组比较，均无明显差异(P>0.05)，ET组细胞直径较对照组增加(34.5±5.5)%(P<0.01)，NO组较对照组增加(6.2±2.5)%(P>0.05)；NO明显抑制ET促3H-Leu掺入率的增加(P<0.01)，NO组与对照组相比，β-MHC mRNA表达明显增加，α-MHC mRNA表达明显减少(P<0.01)，NO显著逆转ET的上述作用。结论：NO有抑制ET促心肌细胞肥大的作用，并可逆转ET致MHC同工蛋白的病理性转换。
, 百拇医药
Effects of nitric oxide on endothelin stimulating
hypertrophy and expression of myosin heavy
chain genes in cultured rat cardiomyocytes
RUAN Chang-wu DAI Gu-zhu
(Institute of Cardiovascular Disease,Tongji Medical University,Wuhan 430022)
FONG Zong-chen QU Shen
(Department of Biochemistry,College of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To discuss the effects of nitric oxide(NO)on endothelin(ET)stimulating hypertrophy and expression of myosin heavy chain(MHC) genes in cultured rat cardiomyocytes.Method：120 large rate were divided into 11 groups.The effect of NO were observed by measuring the diameter and number of cardiomyocytes,incorrporation of 〔3H〕leucine and dot-blot hybridization.Result：The number of cardiomyocytes in both NO group and ET group had no significant (P>0.05) difference from that of control group,ET significantly (P<0.01) increased the diameter of cardiomyoctes by (34.5±5.5)%.NO difference was found between the diameter of cardiomyocytes in NO group (6.2±2.5)% and control group.NO significantly (P<0.01) inhibited ET stimulating 〔3H〕leucine uptake.ET induced switching of MHC gene expression with increases in β-MHC mRNA and decreases in α-MHC mRNA,which was reversed by NO.Conclusion：NO can inhibit ET promoting cardiomyocyte hypertrophy and reverse the pathologic switching of MHC isoform mediated by ET.
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Key words：Nitric oxide Endothelin Myocardial hypertrophy Myosin heavy chain▲
一氧化氮(NO)是近年发现的一种内源性舒张因子，是独立存在于血管、心肌和心内膜等部位中的生理性调节因子，L-精氨酸(L-Arg)在NO合成酶(NOS)作用下合成NO〔1〕。新近研究表明，非血流动力学因素在心肌细胞肥大发生发展过程中发挥重要作用。一些缩血管因子如内皮素(ET)具有直接促心肌细胞肥大作用〔2〕。一些舒血管因子(如NO)则似有心血管保护作用〔1〕。本研究旨在从细胞和分子水平探讨NO对ET促心肌细胞肥大及肌球蛋白重链(MHC)基因表达的影响，以期为心肌肥大的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 心肌细胞培养及分组
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用本所以往建立的方法〔2〕进行大鼠(共120只)心肌细胞分离培养。第5天的原代心肌细胞用于实验。实验设对照组、ET组、ET加L-Arg组(NO组)、ET加L-Arg组加NOS抑制剂(L-NMMA)组(NOSI组)共4组，以观察NO、ET对MHC基因表达的影响；设对照组、ET组、L-Arg组、NO组共4组，以观察NO、ET对心肌细胞3H-亮氨酸(3H-Leu)掺入率的影响；设对照组、ET组、NO组共3组，以观察NO、ET对心肌细胞数目及直径大小的影响。细胞培养第5天加ET-1、L-Arg和L-NMMA(均为Sigma产品)，浓度分别为10-7 mol/L、10-2mol/L、10-5mol/L，干预时间24 h。每组设4只平行瓶或4个平行孔，重复4次实验。
1.2 细胞直径、细胞计数及3H-Leu掺入率测定
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均按本所以往报道〔2〕的方法进行。
1.3 细胞总RNA提取及斑点印迹杂交
按一步法〔3〕提取细胞总RNA。样品保存于-70℃待用。按随机引物标记法(标记盒为PROMEG产品)用同位素32P标记探针。人心肌α-MHC、β-MHC基因探针由日本东京女子大学心脏病研究所Matsuka教授惠赠。按萨姆布鲁克等〔4〕介绍的方法将RNA点样至硝酸纤维素膜(Sigma产品)上，经预杂交、杂交和洗膜，于-70℃放射自显影3 d。用色谱扫描仪(CS93，Japan)对杂交点进行密度扫描定量。
1.4 统计学处理
数据以
±s表示。组间比较用t检验。
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2 结果
2.1 NO、ET对α-MHC、β-MHC基因表达的影响
各组α-MHC、β-MHC基因表达占总MHC含量的百分数见表1，斑点印迹杂交结果见图1。结果表明，ET组β-MHC含量显著增加，α-MHC含量相应减少，NO能逆转ET的上述作用，加入L-NMMA抑制NO的产生，则不能对抗ET致MHC的病理性转换。
表1 NO对ET促大鼠培养心肌细胞MHC基因表达影响%，±s
对照组
ET组
NO组
NOSI组
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α-MHC
80.7±
9.4
16.5±
6.81)
78.4±
7.52)
15.8±
5.63)
β-MHC
19.3±
9.4
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83.5±
6.81)
21.6±
7.52)
84.2±
5.63)
1)与对照组比较；2)与ET组比较；3)与NO组比较，均P<0.01
图1 各组MHC mRNA表达的斑点杂交分析
(β-actin为内掺比)
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2.2 NO、ET对心肌细胞3H-Leu掺入率的影响
ET组、L-Arg组、NO组心肌细胞3H-Leu掺入量与对照组相比分别增加到(206.5±16.2)%(P<0.01)、(108.4±8.7)%(P>0.05)、(127.8±15.6)%(P>0.05)。表明NO明显抑制ET促心肌细胞3H-Leu掺入率的增加。
2.3 NO、ET对心肌细胞数目及直径大小的影响
NO组和ET组的细胞数目分别为(86.2±7.3)个/mm2、(88.9±8.2)个/mm2，与对照组(85.5±6.7)个/mm2相比，均无显著性差异(均P>0.05)。ET组细胞直径，较对照组增加(34.5±5.5)%(P<0.01)；NO组较对照组增加(6.2±2.5)%(P>0.05)。
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3 讨论
3.1 NO抑制ET促心肌细胞肥大及其可能机制
ET是许多心血管疾病中的一种内源性损伤因子，特别是在心肌细胞肥大的发生、发展中起重要作用。本所以往的研究发现，ET可促进心肌细胞肥大并致MHC同工蛋白病理性转换〔2〕。本研究发现，ET组心肌细胞直径较对照组明显增加，NO组心肌细胞直径较对照组相比并无明显差异；ET组、NO组心肌细胞数目与对照组相比均无显著差异；同时发现，NO能显著抑制ET促心肌细胞3H-Leu掺入率的增加，而对正常生长的心肌细胞3H-Leu掺入率无影响。提示NO可抑制ET促心肌细胞肥大，而对正常心肌细胞的生长无明显影响。
NO舒张血管和抑制血管平滑肌细胞增殖的作用是通过活化鸟苷酸环化酶，增加环磷酸鸟苷(cGMP)的产生实现的，cGMP途径是目前所知发挥作用的主要途径〔5〕。然而，NO抑制ET促进心肌细胞肥大的作用机制是否通过cGMP途径，尚不清楚，有待今后进一步研究阐明。
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3.2 NO逆转ET致MHC同工蛋白转换及其意义
NO兼有信使物质与神经递质功能，参与许多细胞生理活动的调节，NO的产生或作用不足与许多疾病病理生理有关。而外源性给予L-Arg或NO供体则可望达到治疗目的〔3〕。最近研究发现，心肌细胞中存在NOS，并能产生NO〔6〕。这为探讨NO与心肌细胞之间的作用提供了依据。
本研究发现L-Arg可抑制ET促β-MHC基因表达，增加α-MHC基因表达，提示NO可逆转ET致MHC同工蛋白病理性转换，且这一作用发生在翻译前水平。加L-NMMA则L-Arg对ET的上述抑制作用消失，表明心肌细胞中确实存在NOS，L-Arg通过心肌细胞中的NOS合成NO发挥作用。
鉴于ET在很多心血管疾病(如冠心病、原发性高血压、心力衰竭等)早期已有明显升高，目前，心肌肥大的防治也无较好的方法。因此，如在这些疾病早期给予NO供体、L-Arg或NOS激活剂治疗，增加体内NO，可能对于心肌肥大的防治有一定作用。■
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参考文献:
[1]Warren J B,Pons F,Brady A J B.Nitric oxide biology;implicatiots for cardiovascular therapeutics.Cardiovasc Res,1994,28:25～27
[2]阮长武，戴闺柱，屈伸，等.内皮素对大鼠培养心肌细胞肥大及肌球蛋白基因表达影响的研究.临床心血管病杂志，1997，6：357～359
[3]Chemzynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolaton by acid guanidinium thiocyante-phenol-chloro-form extraction.Anal Biochem,1987,162:156～158
[4]萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯，主编(金冬雁等译).分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1992.365～368
[5]Dinerman J L,Lowenstein C J,Snydrn S H.Molecular mechanisms of nitric oxide negulation.Circ Res,1993,73:217～219
[6]Kelly R A,Smith T W.Nitric oxide and nitrovasodi-lators:Similarities,differences and interactions.Am J Cardiol,1996,77:2～3
收稿日期：1999-11-30, http://www.100md.com
单位：阮长武(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科 武汉，430022 现在上海市长宁中心医院(200336))；戴闺柱(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科 武汉，430022 导师)；冯宗枕(同济医科大学基础医学院生化教研室)；屈伸(同济医科大学基础医学院生化教研室)
关键词：一氧化氮；内皮素；心肌肥大；肌球蛋白重链
临床心血管病杂志000114 摘 要：目的：探讨一氧化氮(NO)对内皮素(ET)促大鼠培养心肌细胞肥大及肌球蛋白重链(MHC)基因表达的影响。方法：对120只大鼠采用心肌细胞培养及斑点杂交的方法，同时测定心肌细胞直径、数目及3H-亮氨酸(3H-Leu)掺入率。结果：NO组、ET组心肌细胞数目与对照组比较，均无明显差异(P>0.05)，ET组细胞直径较对照组增加(34.5±5.5)%(P<0.01)，NO组较对照组增加(6.2±2.5)%(P>0.05)；NO明显抑制ET促3H-Leu掺入率的增加(P<0.01)，NO组与对照组相比，β-MHC mRNA表达明显增加，α-MHC mRNA表达明显减少(P<0.01)，NO显著逆转ET的上述作用。结论：NO有抑制ET促心肌细胞肥大的作用，并可逆转ET致MHC同工蛋白的病理性转换。
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Effects of nitric oxide on endothelin stimulating
hypertrophy and expression of myosin heavy
chain genes in cultured rat cardiomyocytes
RUAN Chang-wu DAI Gu-zhu
(Institute of Cardiovascular Disease,Tongji Medical University,Wuhan 430022)
FONG Zong-chen QU Shen
(Department of Biochemistry,College of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University)
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Abstract：Objective：To discuss the effects of nitric oxide(NO)on endothelin(ET)stimulating hypertrophy and expression of myosin heavy chain(MHC) genes in cultured rat cardiomyocytes.Method：120 large rate were divided into 11 groups.The effect of NO were observed by measuring the diameter and number of cardiomyocytes,incorrporation of 〔3H〕leucine and dot-blot hybridization.Result：The number of cardiomyocytes in both NO group and ET group had no significant (P>0.05) difference from that of control group,ET significantly (P<0.01) increased the diameter of cardiomyoctes by (34.5±5.5)%.NO difference was found between the diameter of cardiomyocytes in NO group (6.2±2.5)% and control group.NO significantly (P<0.01) inhibited ET stimulating 〔3H〕leucine uptake.ET induced switching of MHC gene expression with increases in β-MHC mRNA and decreases in α-MHC mRNA,which was reversed by NO.Conclusion：NO can inhibit ET promoting cardiomyocyte hypertrophy and reverse the pathologic switching of MHC isoform mediated by ET.
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Key words：Nitric oxide Endothelin Myocardial hypertrophy Myosin heavy chain▲
一氧化氮(NO)是近年发现的一种内源性舒张因子，是独立存在于血管、心肌和心内膜等部位中的生理性调节因子，L-精氨酸(L-Arg)在NO合成酶(NOS)作用下合成NO〔1〕。新近研究表明，非血流动力学因素在心肌细胞肥大发生发展过程中发挥重要作用。一些缩血管因子如内皮素(ET)具有直接促心肌细胞肥大作用〔2〕。一些舒血管因子(如NO)则似有心血管保护作用〔1〕。本研究旨在从细胞和分子水平探讨NO对ET促心肌细胞肥大及肌球蛋白重链(MHC)基因表达的影响，以期为心肌肥大的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 心肌细胞培养及分组
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用本所以往建立的方法〔2〕进行大鼠(共120只)心肌细胞分离培养。第5天的原代心肌细胞用于实验。实验设对照组、ET组、ET加L-Arg组(NO组)、ET加L-Arg组加NOS抑制剂(L-NMMA)组(NOSI组)共4组，以观察NO、ET对MHC基因表达的影响；设对照组、ET组、L-Arg组、NO组共4组，以观察NO、ET对心肌细胞3H-亮氨酸(3H-Leu)掺入率的影响；设对照组、ET组、NO组共3组，以观察NO、ET对心肌细胞数目及直径大小的影响。细胞培养第5天加ET-1、L-Arg和L-NMMA(均为Sigma产品)，浓度分别为10-7 mol/L、10-2mol/L、10-5mol/L，干预时间24 h。每组设4只平行瓶或4个平行孔，重复4次实验。
1.2 细胞直径、细胞计数及3H-Leu掺入率测定
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均按本所以往报道〔2〕的方法进行。
1.3 细胞总RNA提取及斑点印迹杂交
按一步法〔3〕提取细胞总RNA。样品保存于-70℃待用。按随机引物标记法(标记盒为PROMEG产品)用同位素32P标记探针。人心肌α-MHC、β-MHC基因探针由日本东京女子大学心脏病研究所Matsuka教授惠赠。按萨姆布鲁克等〔4〕介绍的方法将RNA点样至硝酸纤维素膜(Sigma产品)上，经预杂交、杂交和洗膜，于-70℃放射自显影3 d。用色谱扫描仪(CS93，Japan)对杂交点进行密度扫描定量。
1.4 统计学处理
数据以
±s表示。组间比较用t检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 NO、ET对α-MHC、β-MHC基因表达的影响
各组α-MHC、β-MHC基因表达占总MHC含量的百分数见表1，斑点印迹杂交结果见图1。结果表明，ET组β-MHC含量显著增加，α-MHC含量相应减少，NO能逆转ET的上述作用，加入L-NMMA抑制NO的产生，则不能对抗ET致MHC的病理性转换。
表1 NO对ET促大鼠培养心肌细胞MHC基因表达影响%，
±s对照组
ET组
NO组
NOSI组
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α-MHC
80.7±
9.4
16.5±
6.81)
78.4±
7.52)
15.8±
5.63)
β-MHC
19.3±
9.4
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83.5±
6.81)
21.6±
7.52)
84.2±
5.63)
1)与对照组比较；2)与ET组比较；3)与NO组比较，均P<0.01
图1 各组MHC mRNA表达的斑点杂交分析
(β-actin为内掺比)
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2.2 NO、ET对心肌细胞3H-Leu掺入率的影响
ET组、L-Arg组、NO组心肌细胞3H-Leu掺入量与对照组相比分别增加到(206.5±16.2)%(P<0.01)、(108.4±8.7)%(P>0.05)、(127.8±15.6)%(P>0.05)。表明NO明显抑制ET促心肌细胞3H-Leu掺入率的增加。
2.3 NO、ET对心肌细胞数目及直径大小的影响
NO组和ET组的细胞数目分别为(86.2±7.3)个/mm2、(88.9±8.2)个/mm2，与对照组(85.5±6.7)个/mm2相比，均无显著性差异(均P>0.05)。ET组细胞直径，较对照组增加(34.5±5.5)%(P<0.01)；NO组较对照组增加(6.2±2.5)%(P>0.05)。
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3 讨论
3.1 NO抑制ET促心肌细胞肥大及其可能机制
ET是许多心血管疾病中的一种内源性损伤因子，特别是在心肌细胞肥大的发生、发展中起重要作用。本所以往的研究发现，ET可促进心肌细胞肥大并致MHC同工蛋白病理性转换〔2〕。本研究发现，ET组心肌细胞直径较对照组明显增加，NO组心肌细胞直径较对照组相比并无明显差异；ET组、NO组心肌细胞数目与对照组相比均无显著差异；同时发现，NO能显著抑制ET促心肌细胞3H-Leu掺入率的增加，而对正常生长的心肌细胞3H-Leu掺入率无影响。提示NO可抑制ET促心肌细胞肥大，而对正常心肌细胞的生长无明显影响。
NO舒张血管和抑制血管平滑肌细胞增殖的作用是通过活化鸟苷酸环化酶，增加环磷酸鸟苷(cGMP)的产生实现的，cGMP途径是目前所知发挥作用的主要途径〔5〕。然而，NO抑制ET促进心肌细胞肥大的作用机制是否通过cGMP途径，尚不清楚，有待今后进一步研究阐明。
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3.2 NO逆转ET致MHC同工蛋白转换及其意义
NO兼有信使物质与神经递质功能，参与许多细胞生理活动的调节，NO的产生或作用不足与许多疾病病理生理有关。而外源性给予L-Arg或NO供体则可望达到治疗目的〔3〕。最近研究发现，心肌细胞中存在NOS，并能产生NO〔6〕。这为探讨NO与心肌细胞之间的作用提供了依据。
本研究发现L-Arg可抑制ET促β-MHC基因表达，增加α-MHC基因表达，提示NO可逆转ET致MHC同工蛋白病理性转换，且这一作用发生在翻译前水平。加L-NMMA则L-Arg对ET的上述抑制作用消失，表明心肌细胞中确实存在NOS，L-Arg通过心肌细胞中的NOS合成NO发挥作用。
鉴于ET在很多心血管疾病(如冠心病、原发性高血压、心力衰竭等)早期已有明显升高，目前，心肌肥大的防治也无较好的方法。因此，如在这些疾病早期给予NO供体、L-Arg或NOS激活剂治疗，增加体内NO，可能对于心肌肥大的防治有一定作用。■
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参考文献:
[1]Warren J B,Pons F,Brady A J B.Nitric oxide biology;implicatiots for cardiovascular therapeutics.Cardiovasc Res,1994,28:25～27
[2]阮长武，戴闺柱，屈伸，等.内皮素对大鼠培养心肌细胞肥大及肌球蛋白基因表达影响的研究.临床心血管病杂志，1997，6：357～359
[3]Chemzynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolaton by acid guanidinium thiocyante-phenol-chloro-form extraction.Anal Biochem,1987,162:156～158
[4]萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯，主编(金冬雁等译).分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1992.365～368
[5]Dinerman J L,Lowenstein C J,Snydrn S H.Molecular mechanisms of nitric oxide negulation.Circ Res,1993,73:217～219
[6]Kelly R A,Smith T W.Nitric oxide and nitrovasodi-lators:Similarities,differences and interactions.Am J Cardiol,1996,77:2～3
收稿日期：1999-11-30, http://www.100md.com