球旁注射高三尖杉酯碱在兔眼球组织的分布
作者：闫芳 刘金祥 陈常松 李俊生
单位：闫芳 刘金祥 李俊生(临沂市人民医院临床药学室)；陈常松(临沂市药品检验所，临沂 276003)
关键词：高三尖杉酯碱；分布；高效液相色谱
中国临床药理学与治疗学000115
目的 建立测定兔眼球组织中高三尖杉酯碱(HHT)的含量及其分布。方法 以三尖杉酯碱(HT)为内标，荧光法检测；眼球旁注射HHT，分离各眼球组织分别制匀浆、萃取后进行测定。结果 HHT与HT的保留时间(tR)分别为6.35 min和4.70 min；在5～200 μg.L-1线性相关系数为0.994。平均加样回收率为(93.17±4.31)%。眼球旁注射HHT 2 mg后兔眼各组织含量按巩膜、角膜、视网膜、玻璃体、晶状体依次下降，并且巩膜组织内含量远高于其他组织，但消除速率却呈相反顺序。结论 球旁注射HHT可以分布至眼球各组织。
, 百拇医药
中图分类号 R914.1
Determination of homoharringtonine distribution in eyeball tissue of rabbit by high performance liquid chromatography method
YAN Fang LIU Jin-Xiang CHEN Chang-Song LI Jun-Sheng
(Department of Clinical Pharmacy，Linyi Municipal People's Hospital，Linyi 276003)
Aim To observe homoharringtonine(HHT) distribution in eyeball tissue of rabbit.Methods Harringtonine(HT) was used as internal standard.The chromatography consisted of Kromasil C18 column with methanol 0.01mol.L-1 (60∶40，pH 2.5) as the mobile phase at the flow rate of 0.8ml.min-1.Results The chromatography retention time of HHT and HT were 6.35min and 4.70min.The standard curve was linear in the concentration range of 5～200 μg.L-1 in serum and the relation coefficient was 0.994.The recovery of spiked sample was(93.17±4.31)%.After injection of 2mg of HHT in side of rabbit eyeball,the contents in sclera,cornea,retina,vitreous body and crystalline lens were reduced progressively,but the eliminate rate were reduced in a proper order.Conclusion HHT can distribute to every eyeball tissue when it was injected in side of rabbit eyeball.
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Key words homoharringtonine；distribution；high perfomance liquid chromatography
高三尖杉酯碱(homoharringtonine，HHT)是从我国特有的植物三尖杉属植物中分离提取的，目前在临床主要用于急性非淋巴细胞白血病的治疗，效果良好。近年有研究发现，HHT能够抑制体外培养的人眼翼状胬肉成纤维细胞的生长[1]，而细胞的过度增长同样是增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的直接原因[2]，由此临床医生认为HHT对PVR应具有防治作用，临床实验证实了这一点。但将药物直接注射于玻璃体内时，副作用大且毒性增加，临床提出球旁注射给药方法。为测定球旁注射后眼球中有关组织内的HHT含量，并进一步观察其消除情况，提供眼球旁注射HHT治疗PVR的有关药动学数据，进而观察HHT对PVR的作用机理，本实验以三尖杉酯碱(harringtonine,HT)为内标，荧光检测器检测，建立了测定眼球组织中HHT含量的反相高效液相色谱法。
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1 材料与方法
1.1 材料 HHT与HT对照品(中国药品生物制品检定所)，HHT 注射液(杭州民生药厂，批号980327)，甲醇为色谱纯，其余所用试剂为优级纯或分析纯。高效液相色谱系统(美国Waters公司)，RF-5301PC荧光分光光度计色谱检测件(日本Shmadzu株式会社)，色谱柱及预柱(天津Turner科学仪器公司)，TC-100柱保温装置(天津金洲科学仪器公司)。新西兰大白兔(山东省医学科学院实验动物中心，鲁动质05990315号，雌雄不拘)。
1.2 色谱条件 Kromasil C18柱(5 μm，250 mm ×3.9mm ID)，YWG C18预柱，甲醇:0.01 mol.L-1磷酸二氢钾(60∶40，磷酸调pH2.5)为流动相[3]，并由序惯单纯形法[4]确定此为最佳配比点，流速0.8 ml.min-1，荧光检测激发波长290 nm、检测发射波长320 nm，检测灵敏度0.01Aufs。
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1.3 建立工作方程 精密称取HHT与HT对照品适量，分别用50%甲醇溶液溶解定容，制成对照品贮备液。取正常空白兔眼球，分离巩膜、角膜、视网膜、晶状体和玻璃体，分别称重，捣碎后与精密量取的HHT与HT对照品贮备液适量共置匀浆器中，用氯仿2 ml进行匀浆，并用氯仿2 ml冲洗，合并氯仿匀浆液，密闭静置，分离下层氯仿液2 ml，制成含HHT分别为5、10、20、50、80、100、150、200 μg.L-1、HT均为100 μg.L-1的系列浓度溶液，40 ℃水浴中用氮气流吹干，用0.1 ml流动相重组后进样15 μl。以HHT浓度对(样品/内标)峰高比进行线性回归。
1.4 方法质量控制 取测定结果后的眼球样品按标准曲线下制备氯仿匀浆，取对照品贮备液制成含HHT分别为10，80，150 μg.L-1、HT均为100 μg.L-1的样品溶液，同1.3项下处理后进样，连续测定5次，计算加样回收率。
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分别将标准曲线项各浓度的正常空白兔眼球-对照品贮备液制成的样品溶液重复5次进样，连续测定5 d，计算日内误差与日间误差。按信噪比(S/N)=3方法计算眼球组织匀浆中HHT的最低检测浓度。
1.5 样品测定 取兔5只，体重(2.76±0.52)kg，正常饮食饮水，于两侧眼球旁各注射HHT 2mg，于注射后5h和10h 各取出一侧眼球，滤纸吸干，分离巩膜、角膜、视网膜、晶状体和玻璃体，分别称重，置匀浆于试管中，各加入400ng HT后，后操作同1.3项。
2 结果
2.1 色谱图 样品HHT与内标HT色谱行为良好，与组织中杂质能完全分离，保留时间tR分别为6.35 min和4.70 min。有关色谱图见图1。
图1 HHT(1)和内标HT(2)对照品(A)和眼球组织匀浆中样品(B)
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2.2 工作方程 以HHT组织匀浆浓度(C)对(样品/内标)峰高比(R)进行线性回归，得工作曲线方程为C=95.238 R-0.238，r=0.994。可见在5～200 μg.L-1范围内浓度值与峰高比值具有良好线性相关。
2.3 方法质量控制 HHT高中低3种浓度的平均加样回收率为(93.17±4.31)%，具体结果见表1。重现性考察结果表明标准工作曲线方程的斜率和截距日内、日间误差均<6，结果见表2。方法的最低检测限为1 μg.L-1。
表1 方法加样回收率(
±s,n=5) 加入浓度
/ug.L-1
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测得浓度
/ug.L-1
加收率
/%
平均加收率
/%
10
9.35±0.46
93.53±4.92
80
74.84±3.49
93.54±4.66
, 百拇医药
93.17±4.31
150
138.67±4.65
92.45±3.35
表2 方法重现性考察结果(±s,n=5)
日内
日间
斜率
94.56±7.72
94.67±5.62
RSD%
, 百拇医药
4.99
5.94
截距
0.240±0.010
0.234±0.014
RSD%
4.17
5.98
2.4 样品测定结果 眼球旁注射HHT2 mg 5 h和10 h后兔眼各有关组织样品的含量结果见表3。可见不论5 h还是10 h时其含量均为按巩膜、角膜、视网膜、玻璃体、晶状体以次下降，并且巩膜组织内含量远高于其他，但下降速率却呈相反顺序。表3 兔眼各有关组织样品的含量结果(±s,n=5) 组织
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5h
10h
10h/5h
巩膜
0.374±0.158
0.156±0.070
0.417
角膜
0.090±0.044
0.042±0.019
0.467
视网膜
, http://www.100md.com 0.054±0.036
0.021±0.012
0.389
晶状体
0.012±0.007
0.010±0.006
0.833
玻璃体
0.024±0.015
0.016±0.008
0.667
3 讨论
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HHT是一种细胞周期非特异性药物，主要杀伤处于S期的细胞，对G1期向S期的移行及G2期向M期的移行也具有较强的阻断作用，从而抑制细胞的DNA合成和蛋白质合成[5]；当前人们认为，PVR的发生是由于外伤、炎症以及出血引起的一种过度的损伤修复反应，并且在PVR的发生和发展过程中，成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞和视网膜神经胶质细胞有着非常重要的作用，这可以看作HHT治疗PVR有效的病理-药理学基础。
本实验通过建立高效液相色谱测定眼球组织HHT含量的方法，测定了通过眼球旁注射后，HHT在眼球各有关组织中的分布情况，虽然玻璃体内药物含量并非最高，但是可以在其中维持较长的时间，这对于PVR的预防和治疗是有利的。
闫芳，女，45岁，副主任药师，主要从事临床药理学工作。
参考文献
, 百拇医药
1，王雨生，严密.翼状胬肉的治疗及其并发症.国外医学眼科学分册1994,18(2):116
2，惠延年.科隆国际增殖性玻璃体视网膜病变讨论会.国外医学眼科学分册1989,13(2):103
3，高素英，林履基.高效液相色谱法测定高三尖杉酯碱注射液含量.药物分析杂志1999,19(2):103
4，丁养军，尤进茂.序惯单纯形法确定高效液相色谱流动相各组分最佳配比.色谱1995,13(6):477
5，郭瑞臣，傅平.现代临床药理学.赤峰：内蒙古科学技术出版社,1995:196
收稿日期：2000-01-04, 百拇医药
单位：闫芳 刘金祥 李俊生(临沂市人民医院临床药学室)；陈常松(临沂市药品检验所，临沂 276003)
关键词：高三尖杉酯碱；分布；高效液相色谱
中国临床药理学与治疗学000115
目的 建立测定兔眼球组织中高三尖杉酯碱(HHT)的含量及其分布。方法 以三尖杉酯碱(HT)为内标，荧光法检测；眼球旁注射HHT，分离各眼球组织分别制匀浆、萃取后进行测定。结果 HHT与HT的保留时间(tR)分别为6.35 min和4.70 min；在5～200 μg.L-1线性相关系数为0.994。平均加样回收率为(93.17±4.31)%。眼球旁注射HHT 2 mg后兔眼各组织含量按巩膜、角膜、视网膜、玻璃体、晶状体依次下降，并且巩膜组织内含量远高于其他组织，但消除速率却呈相反顺序。结论 球旁注射HHT可以分布至眼球各组织。
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中图分类号 R914.1
Determination of homoharringtonine distribution in eyeball tissue of rabbit by high performance liquid chromatography method
YAN Fang LIU Jin-Xiang CHEN Chang-Song LI Jun-Sheng
(Department of Clinical Pharmacy，Linyi Municipal People's Hospital，Linyi 276003)
Aim To observe homoharringtonine(HHT) distribution in eyeball tissue of rabbit.Methods Harringtonine(HT) was used as internal standard.The chromatography consisted of Kromasil C18 column with methanol 0.01mol.L-1 (60∶40，pH 2.5) as the mobile phase at the flow rate of 0.8ml.min-1.Results The chromatography retention time of HHT and HT were 6.35min and 4.70min.The standard curve was linear in the concentration range of 5～200 μg.L-1 in serum and the relation coefficient was 0.994.The recovery of spiked sample was(93.17±4.31)%.After injection of 2mg of HHT in side of rabbit eyeball,the contents in sclera,cornea,retina,vitreous body and crystalline lens were reduced progressively,but the eliminate rate were reduced in a proper order.Conclusion HHT can distribute to every eyeball tissue when it was injected in side of rabbit eyeball.
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Key words homoharringtonine；distribution；high perfomance liquid chromatography
高三尖杉酯碱(homoharringtonine，HHT)是从我国特有的植物三尖杉属植物中分离提取的，目前在临床主要用于急性非淋巴细胞白血病的治疗，效果良好。近年有研究发现，HHT能够抑制体外培养的人眼翼状胬肉成纤维细胞的生长[1]，而细胞的过度增长同样是增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的直接原因[2]，由此临床医生认为HHT对PVR应具有防治作用，临床实验证实了这一点。但将药物直接注射于玻璃体内时，副作用大且毒性增加，临床提出球旁注射给药方法。为测定球旁注射后眼球中有关组织内的HHT含量，并进一步观察其消除情况，提供眼球旁注射HHT治疗PVR的有关药动学数据，进而观察HHT对PVR的作用机理，本实验以三尖杉酯碱(harringtonine,HT)为内标，荧光检测器检测，建立了测定眼球组织中HHT含量的反相高效液相色谱法。
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1 材料与方法
1.1 材料 HHT与HT对照品(中国药品生物制品检定所)，HHT 注射液(杭州民生药厂，批号980327)，甲醇为色谱纯，其余所用试剂为优级纯或分析纯。高效液相色谱系统(美国Waters公司)，RF-5301PC荧光分光光度计色谱检测件(日本Shmadzu株式会社)，色谱柱及预柱(天津Turner科学仪器公司)，TC-100柱保温装置(天津金洲科学仪器公司)。新西兰大白兔(山东省医学科学院实验动物中心，鲁动质05990315号，雌雄不拘)。
1.2 色谱条件 Kromasil C18柱(5 μm，250 mm ×3.9mm ID)，YWG C18预柱，甲醇:0.01 mol.L-1磷酸二氢钾(60∶40，磷酸调pH2.5)为流动相[3]，并由序惯单纯形法[4]确定此为最佳配比点，流速0.8 ml.min-1，荧光检测激发波长290 nm、检测发射波长320 nm，检测灵敏度0.01Aufs。
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1.3 建立工作方程 精密称取HHT与HT对照品适量，分别用50%甲醇溶液溶解定容，制成对照品贮备液。取正常空白兔眼球，分离巩膜、角膜、视网膜、晶状体和玻璃体，分别称重，捣碎后与精密量取的HHT与HT对照品贮备液适量共置匀浆器中，用氯仿2 ml进行匀浆，并用氯仿2 ml冲洗，合并氯仿匀浆液，密闭静置，分离下层氯仿液2 ml，制成含HHT分别为5、10、20、50、80、100、150、200 μg.L-1、HT均为100 μg.L-1的系列浓度溶液，40 ℃水浴中用氮气流吹干，用0.1 ml流动相重组后进样15 μl。以HHT浓度对(样品/内标)峰高比进行线性回归。
1.4 方法质量控制 取测定结果后的眼球样品按标准曲线下制备氯仿匀浆，取对照品贮备液制成含HHT分别为10，80，150 μg.L-1、HT均为100 μg.L-1的样品溶液，同1.3项下处理后进样，连续测定5次，计算加样回收率。
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分别将标准曲线项各浓度的正常空白兔眼球-对照品贮备液制成的样品溶液重复5次进样，连续测定5 d，计算日内误差与日间误差。按信噪比(S/N)=3方法计算眼球组织匀浆中HHT的最低检测浓度。
1.5 样品测定 取兔5只，体重(2.76±0.52)kg，正常饮食饮水，于两侧眼球旁各注射HHT 2mg，于注射后5h和10h 各取出一侧眼球，滤纸吸干，分离巩膜、角膜、视网膜、晶状体和玻璃体，分别称重，置匀浆于试管中，各加入400ng HT后，后操作同1.3项。
2 结果
2.1 色谱图 样品HHT与内标HT色谱行为良好，与组织中杂质能完全分离，保留时间tR分别为6.35 min和4.70 min。有关色谱图见图1。
图1 HHT(1)和内标HT(2)对照品(A)和眼球组织匀浆中样品(B)
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2.2 工作方程 以HHT组织匀浆浓度(C)对(样品/内标)峰高比(R)进行线性回归，得工作曲线方程为C=95.238 R-0.238，r=0.994。可见在5～200 μg.L-1范围内浓度值与峰高比值具有良好线性相关。
2.3 方法质量控制 HHT高中低3种浓度的平均加样回收率为(93.17±4.31)%，具体结果见表1。重现性考察结果表明标准工作曲线方程的斜率和截距日内、日间误差均<6，结果见表2。方法的最低检测限为1 μg.L-1。
表1 方法加样回收率(
±s,n=5) 加入浓度/ug.L-1
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测得浓度
/ug.L-1
加收率
/%
平均加收率
/%
10
9.35±0.46
93.53±4.92
80
74.84±3.49
93.54±4.66
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93.17±4.31
150
138.67±4.65
92.45±3.35
表2 方法重现性考察结果(
±s,n=5)日内
日间
斜率
94.56±7.72
94.67±5.62
RSD%
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4.99
5.94
截距
0.240±0.010
0.234±0.014
RSD%
4.17
5.98
2.4 样品测定结果 眼球旁注射HHT2 mg 5 h和10 h后兔眼各有关组织样品的含量结果见表3。可见不论5 h还是10 h时其含量均为按巩膜、角膜、视网膜、玻璃体、晶状体以次下降，并且巩膜组织内含量远高于其他，但下降速率却呈相反顺序。表3 兔眼各有关组织样品的含量结果(
±s,n=5) 组织, http://www.100md.com
5h
10h
10h/5h
巩膜
0.374±0.158
0.156±0.070
0.417
角膜
0.090±0.044
0.042±0.019
0.467
视网膜
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0.021±0.012
0.389
晶状体
0.012±0.007
0.010±0.006
0.833
玻璃体
0.024±0.015
0.016±0.008
0.667
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HHT是一种细胞周期非特异性药物，主要杀伤处于S期的细胞，对G1期向S期的移行及G2期向M期的移行也具有较强的阻断作用，从而抑制细胞的DNA合成和蛋白质合成[5]；当前人们认为，PVR的发生是由于外伤、炎症以及出血引起的一种过度的损伤修复反应，并且在PVR的发生和发展过程中，成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞和视网膜神经胶质细胞有着非常重要的作用，这可以看作HHT治疗PVR有效的病理-药理学基础。
本实验通过建立高效液相色谱测定眼球组织HHT含量的方法，测定了通过眼球旁注射后，HHT在眼球各有关组织中的分布情况，虽然玻璃体内药物含量并非最高，但是可以在其中维持较长的时间，这对于PVR的预防和治疗是有利的。
闫芳，女，45岁，副主任药师，主要从事临床药理学工作。
参考文献
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1，王雨生，严密.翼状胬肉的治疗及其并发症.国外医学眼科学分册1994,18(2):116
2，惠延年.科隆国际增殖性玻璃体视网膜病变讨论会.国外医学眼科学分册1989,13(2):103
3，高素英，林履基.高效液相色谱法测定高三尖杉酯碱注射液含量.药物分析杂志1999,19(2):103
4，丁养军，尤进茂.序惯单纯形法确定高效液相色谱流动相各组分最佳配比.色谱1995,13(6):477
5，郭瑞臣，傅平.现代临床药理学.赤峰：内蒙古科学技术出版社,1995:196
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