牛磺酸对大鼠心肌损伤时心肌细胞核钙转运功能异常的保护作用
作者：万福生 曾昭建 赵小曼 罗达亚
单位：江西医学院生化与分子生物学教研室，南昌 330006
关键词：心肌损伤；钙转运；细胞核；牛磺酸
中国临床药理学与治疗学000107
目的 观察异丙肾上腺素(ISO)致大鼠心肌缺血损伤时心肌细胞核钙转运功能的异常变化及牛磺酸对其影响。方法 给Wister大鼠皮下注射5 mg.kg-1ISO液，造成心肌缺血损伤模型。超速离心分离纯化心肌细胞核。酶学方法鉴定核纯度和测定核膜Ca 2+-ATP酶活性，同位素法观测核钙的摄取。结果 与正常对照组比较，心肌缺血组(实验组)心肌细胞核膜钙依赖性ATPase活性降低18.1%(P<0.05)，45Ca 2+摄取效率也显著降低，其最大速度降低54.6%；牛磺酸保护组心肌细胞核Ca 2+-ATPase活性及核45Ca2+摄取与正常对照组比较均未见显著性改变。结论 牛磺酸对ISO致大鼠心肌损伤时心肌细胞核钙转运功能降低有保护作用。
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中图分类号 R542.2
Effects of Taurine on dysfunction of myocardial nuclear calcium transport in rat myocardial injury induced with isoproterenol
WAN Fu-Sheng ZENG Zhao-Jian ZHAO Xiao-Man LUO Da-Ya
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Jiangxi Medical College,Nanchang 330006)
Aim To observe the dysfunction of myocardial nuclear calcium transport in rat myocardial injury and effects of taurine on it.Methods The model of myocardial damage was induced by subcutaneous injection of isoproterenol (ISO,5 mg.kg-1.d-1).Myocardial nuclei were purified with Sucrose density centrifugation and identified zymologically.The activity of Ca2+-ATPase was measured zymologically and calcium uptake was assayed with 45Ca2+ isotope.Results Compared with the control,the Ca2+-ATPase activity of myocardial nuclear in ischemia group was decreased by 18.1%(P<0.05),the nuclear 45Ca2+ uptake was significant decreased and Vmax value was lowered by 54.6%.With the control group Ca2+-ATPase activity and 45Ca2+ uptake in the myocardial nuclei of Tau group showed no significant changes.Conclusion The above results indicated taurine has notable protective effects on dysfunction of nuclear calcium transport in rat myocardium.
, 百拇医药
Key words myocardial injury;Ca2+ transport; nucleus;taurin
钙是细胞内重要的第二信使物质，参与细胞功能代谢的调节。近年研究发现[1]，细胞核Ca2+ 是调节细胞分化、增殖、凋亡及基因表达等功能的重要信号分子，但影响核钙转运的调节因素尚不清。牛磺酸(taurine,Tau)具有调节细胞钙稳态，清除自由基等细胞保护作用[2,3],但Tau 对核Ca2+ 转运系统的影响尚未见报道。本研究采用异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)制造大鼠心肌损伤模型，观察心肌损伤时细胞核Ca2+ 泵活性和核钙摄取的变化及Tau对其影响，以探讨Tau对心肌损伤时细胞核钙转运功能异常的保护作用。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 试剂 牛磺酸、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、二硫苏糖醇(DTT)、磷酸二羟丙酮酸(PEP)、苯*****(PMSF)、丙酮酸激酶、琥珀酸脱氢酶(SDH)、5'-核苷酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶均为Sigma 公司产品，ISO为上海禾丰制药厂产品，其它试剂为国产GR或AR级产品。
1.2 实验动物及分组[3] 雄性Wister 大鼠50 只(由本院实验动物中心提供)，体重210 ～ 255 g 。将大鼠随机分正常对照组(C)、缺血组(I)及3个牛磺酸保护组(T)。缺血组(I)：皮下注射5 mg.kg-1 ISO液，24 h后再注射相同剂量1次、第2次注射 ISO后60 min处死动物； 牛磺酸保护组(T)： 在注射ISO前60 min分别腹腔注射100 mg.kg-1(T1)、150 mg.kg-1 (T2)、200 mg.kg-1 (T3)液，余操作同缺血组； 正常对照组(C)：注射等体积生理盐水，余操作同缺血组。
, 百拇医药
1.3 心肌细胞核的分离纯化与鉴定[4～6] 大鼠处死后速取出心脏，用冷生理盐水洗净血液，去结缔组织，剪碎后加6倍体积等渗匀浆介质(含0.25 mmol.L-1蔗糖、5.0 mmol.L-1 Tris/HCl、pH 7.4、25 mmol.L-1 KCl 、5.0 mmol.L-1 MgCl2 和1.0 mmol.L-1 EGTA)，用内切式匀浆器低速匀浆(反复5次，每次10 s )，2层纱布过滤后离心(1200×g ，4℃)10 min，将沉淀再匀浆并同上离心一次，弃上清，沉淀中加入适量体积的含1.0 mol·L-1 蔗糖缓冲液(pH 7.4)，充分混匀后加入3倍体积含2.6 mol·L-1 的蔗糖缓冲液，混匀后超速离心(110000×g ，4 ℃)60min ，沉淀即为纯化的心肌细胞核。用二苯胺法测DNA含量，Lowry法进行蛋白定量，按文献方法测5'-核苷酸酶、琥珀酸脱氢酶及葡萄糖-6-磷酸酶活性。用原子吸收分光光度法测定Ca2+含量。心肌细胞核的获得率以mg·g-1 心肌湿重表示。
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1.4 核膜Ca2+-ATPase活性测定 按文献[5]方法进行，Ca2+-ATPase 活性为总ATPase活性与Mg2+-ATPase活性之差。 酶活性单位为nmol.mg Pro-1.min-1 。
1.5 核45Ca2+转运测定[5] 反应液为(mmol· L-1)：KCl 125.0、HEPE 20.0、MgCl2 5.0、pH 7.0、ATP 2.0、EGTA 0.1，45Ca2+ 18.5 kBq，反应体系中游离Ca2+浓度同Ca2+-ATP ase 的测定，终容积为0.5 ml 。37 ℃预温5 min后加入0.2 mg蛋白质的核，孵育一定时间后加入1 ml 0.2 mol·L-1 MgCl2 终止反应，以0.45 um 微孔滤膜抽滤，滤膜干燥后加入闪烁液，然后测定45Ca2+放射强度。同时做非特异性摄入管，方法同上，但反应体系中不含ATP。核45Ca2+转运等于总摄入量与非特异摄入量之差，以nmol.g Pro-1 表示。
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1.6 统计学处理 结果以均数±标准差(
±s)表示，并采用t 检验作组间比较分析。
2 结果
2.1 心肌细胞核得率及标志酶活性 本实验制备的心肌细胞核在显微镜下无细胞碎片污染，核回收率为16.5%，核蛋白质含量较匀浆低38倍，核蛋白质与DNA含量比值9.5，各亚细胞标志酶活性均低于匀浆的5%。
2.2 心肌细胞核钙ATP酶活性变化及Tau对其影响(见表1) 与对照组比较，心肌缺血大鼠心肌匀浆和核内钙含量分别增加43%和48%(P<0.05)，Ca2+-ATPase活性分别降低10.9%和18.1%(P<0.05)；Tau 保护组中核Ca2+-ATPase 活性及Ca2+ 含量未见显著性变化。说明Tau 对缺血心肌细胞核ATPase 活性降低及Ca2+ 含量升高有保护作用，且此作用有剂量依赖关系。
, 百拇医药
表1 心肌细胞核钙泵活性及核钙含量变化(±s,n=10) 组别
Ca2+含量mmol.mg Pro-1
Ca2+-ATPase活性/nmol.mg Pro-1.min-1
心肌匀浆
细胞核
心肌匀浆
细胞核
正常对照组
, 百拇医药
23.5±4.1
27.9±4.5
25.6±4.7
39.8±3.2
缺血组
33.6±4.8**
41.3±6.2**
22.8±4.2*
32.6±3.0**
T1组100mg.kg-1
, 百拇医药
27.1±4.6△
34.1±4.5△
25.1±3.1△
36.6±3.1△
T2组150mg.kg-1
26.3±5.1△
32.5±4.2△
25.9±2.8△
37.1±3.3△
, 百拇医药
T3组200mg.kg-1
25.7±5.3△
30.2±4.3△△
26.8±4.5△
38.7±3.5△△
与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与缺血组比较△P<0.05,△△P<0.01
2.3 心肌细胞核45 Ca2+摄取的改变及Tau 的影响(图1) 在ATP存在下，大鼠心肌细胞核45Ca2+摄取具有Ca2+ 浓度依赖性，随Ca2+ 浓度升高而增加，在500 nmol.L-1 范围内呈线性关系，以后逐渐饱和。缺血组心肌细胞核在Ca2+ 各浓度点的45Ca2+摄取量均显著低于正常对照组(P<0.01)，Tau 保护组(200 mg.kg-1 )与对照组比较未见显著性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
图1 心肌细胞核钙摄取变化
3 讨论
细胞核钙来源于胞浆钙，胞浆Ca2+进入核内不仅通过核孔被动摄取，且在核膜上存在钙泵和IP3受体等核钙主动转运系统[7,8]。Ca2+是胞内重要第二信使，它不仅参与细胞功能代谢的调节，核内钙还参与细胞增殖、发育、分化及细胞凋亡等核功能的调节[1,9]。在心肌衰竭、心肌缺血、心肌梗塞、及缺血再灌注损伤等病理状况下，不但有心功能损伤，而且有心肌质膜、线粒体及肌浆网的钙转运功能障碍，导致胞内钙超载。钙超载是心血管疾病共同发病的重要环节之一[10]。牛磺酸具有调节胞内钙稳态、清除自由基等重要生物学功能，对心血管疾病具有广泛的防治作用[2]。本次实验采用ISO诱导大鼠心肌缺血损伤，观察牛磺酸对心肌缺血损伤时核钙转运系统的影响。所制备的心肌细胞核纯度高，蛋白质比值低，胞内其它亚细胞标志酶活性均低于5%。研究发现，缺血组大鼠心肌细胞核钙泵活性及核膜钙摄取功能均显著低于对照组(P<0.05)，而核内钙含量又显著高于对照组，表明核内Ca2+ 升高可能通过其它途径进入核内。核钙泵活性与核钙摄取功能并不完全一致，也进一步证实核钙转运除钙泵外，还有其它钙转运形式存在。牛磺酸保护组心肌核钙含量及核膜钙泵活性及45Ca2+摄取功能与对照组比较未见显著性差异。可见，牛磺酸对ISO致心肌缺血损伤时核钙转运功能异常有很好的保护作用，该保护作用的病理生理意义值得进一步研究。
, 百拇医药
万福生，男，42岁，硕士，副教授，主要从事血管生化及分子生物学研究。
参考文献
1，Allbitton NL,Oancea E,Kuhn Ma, et al.Source of nuclear calcium signals.Proc Natl Acad Sci USA,1994; 91(12):458
2，宿燕岗、杨英珍、陈灏珠.牛磺酸及其在心血管系统疾病中的应用.国外医学心血管疾病分册，1996 ;23(3):138
3，万福生，赵小曼，雷厉.牛磺酸对大鼠心肌缺血损伤的保护.中国药理学通报,1996;12(1):42
4，Nicotera P,Mcconkey DJ,Jones DP, et al.ATP stimulates Ca uptake and increases the free Ca concentration in isolated rat liver nuclei.Pro Natl Acad Sci USA,1989;86:453
, http://www.100md.com
5，Janes LR,Beseech HR.Isolation of canine cardiac sarcolemmal vesicles.Meth pharmacol,1984;5:1
6，Dixon TG,Purdom M.Serum-5'-nucleotidase.J Clin Pathol,1954;7:341
7，Czubryt MP,Ramjia WB,Gilchrist J, et al.The presence and partitioning of calcium binding proteins in hepatic and cardiac nuclei.J Mol Cell Cardiol,1996; 28:455
8，王培勇、汤健、庞永政，等.心肌细胞核上存在钙转运系统.北京医科大学学报,1997;29 (1)：11
9，Trump BE,Berezesky Ik.Calcium mediated cell injury and cell death.FASEB J,1995;9:219
10，Clapham DE.Calcium Signalling.Cell,1995;80:259
收稿日期：1999-12-10
修回日期：2000-02-16, 百拇医药
单位：江西医学院生化与分子生物学教研室，南昌 330006
关键词：心肌损伤；钙转运；细胞核；牛磺酸
中国临床药理学与治疗学000107
目的 观察异丙肾上腺素(ISO)致大鼠心肌缺血损伤时心肌细胞核钙转运功能的异常变化及牛磺酸对其影响。方法 给Wister大鼠皮下注射5 mg.kg-1ISO液，造成心肌缺血损伤模型。超速离心分离纯化心肌细胞核。酶学方法鉴定核纯度和测定核膜Ca 2+-ATP酶活性，同位素法观测核钙的摄取。结果 与正常对照组比较，心肌缺血组(实验组)心肌细胞核膜钙依赖性ATPase活性降低18.1%(P<0.05)，45Ca 2+摄取效率也显著降低，其最大速度降低54.6%；牛磺酸保护组心肌细胞核Ca 2+-ATPase活性及核45Ca2+摄取与正常对照组比较均未见显著性改变。结论 牛磺酸对ISO致大鼠心肌损伤时心肌细胞核钙转运功能降低有保护作用。
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中图分类号 R542.2
Effects of Taurine on dysfunction of myocardial nuclear calcium transport in rat myocardial injury induced with isoproterenol
WAN Fu-Sheng ZENG Zhao-Jian ZHAO Xiao-Man LUO Da-Ya
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Jiangxi Medical College,Nanchang 330006)
Aim To observe the dysfunction of myocardial nuclear calcium transport in rat myocardial injury and effects of taurine on it.Methods The model of myocardial damage was induced by subcutaneous injection of isoproterenol (ISO,5 mg.kg-1.d-1).Myocardial nuclei were purified with Sucrose density centrifugation and identified zymologically.The activity of Ca2+-ATPase was measured zymologically and calcium uptake was assayed with 45Ca2+ isotope.Results Compared with the control,the Ca2+-ATPase activity of myocardial nuclear in ischemia group was decreased by 18.1%(P<0.05),the nuclear 45Ca2+ uptake was significant decreased and Vmax value was lowered by 54.6%.With the control group Ca2+-ATPase activity and 45Ca2+ uptake in the myocardial nuclei of Tau group showed no significant changes.Conclusion The above results indicated taurine has notable protective effects on dysfunction of nuclear calcium transport in rat myocardium.
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Key words myocardial injury;Ca2+ transport; nucleus;taurin
钙是细胞内重要的第二信使物质，参与细胞功能代谢的调节。近年研究发现[1]，细胞核Ca2+ 是调节细胞分化、增殖、凋亡及基因表达等功能的重要信号分子，但影响核钙转运的调节因素尚不清。牛磺酸(taurine,Tau)具有调节细胞钙稳态，清除自由基等细胞保护作用[2,3],但Tau 对核Ca2+ 转运系统的影响尚未见报道。本研究采用异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)制造大鼠心肌损伤模型，观察心肌损伤时细胞核Ca2+ 泵活性和核钙摄取的变化及Tau对其影响，以探讨Tau对心肌损伤时细胞核钙转运功能异常的保护作用。
1 材料与方法
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1.2 实验动物及分组[3] 雄性Wister 大鼠50 只(由本院实验动物中心提供)，体重210 ～ 255 g 。将大鼠随机分正常对照组(C)、缺血组(I)及3个牛磺酸保护组(T)。缺血组(I)：皮下注射5 mg.kg-1 ISO液，24 h后再注射相同剂量1次、第2次注射 ISO后60 min处死动物； 牛磺酸保护组(T)： 在注射ISO前60 min分别腹腔注射100 mg.kg-1(T1)、150 mg.kg-1 (T2)、200 mg.kg-1 (T3)液，余操作同缺血组； 正常对照组(C)：注射等体积生理盐水，余操作同缺血组。
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1.3 心肌细胞核的分离纯化与鉴定[4～6] 大鼠处死后速取出心脏，用冷生理盐水洗净血液，去结缔组织，剪碎后加6倍体积等渗匀浆介质(含0.25 mmol.L-1蔗糖、5.0 mmol.L-1 Tris/HCl、pH 7.4、25 mmol.L-1 KCl 、5.0 mmol.L-1 MgCl2 和1.0 mmol.L-1 EGTA)，用内切式匀浆器低速匀浆(反复5次，每次10 s )，2层纱布过滤后离心(1200×g ，4℃)10 min，将沉淀再匀浆并同上离心一次，弃上清，沉淀中加入适量体积的含1.0 mol·L-1 蔗糖缓冲液(pH 7.4)，充分混匀后加入3倍体积含2.6 mol·L-1 的蔗糖缓冲液，混匀后超速离心(110000×g ，4 ℃)60min ，沉淀即为纯化的心肌细胞核。用二苯胺法测DNA含量，Lowry法进行蛋白定量，按文献方法测5'-核苷酸酶、琥珀酸脱氢酶及葡萄糖-6-磷酸酶活性。用原子吸收分光光度法测定Ca2+含量。心肌细胞核的获得率以mg·g-1 心肌湿重表示。
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1.4 核膜Ca2+-ATPase活性测定 按文献[5]方法进行，Ca2+-ATPase 活性为总ATPase活性与Mg2+-ATPase活性之差。 酶活性单位为nmol.mg Pro-1.min-1 。
1.5 核45Ca2+转运测定[5] 反应液为(mmol· L-1)：KCl 125.0、HEPE 20.0、MgCl2 5.0、pH 7.0、ATP 2.0、EGTA 0.1，45Ca2+ 18.5 kBq，反应体系中游离Ca2+浓度同Ca2+-ATP ase 的测定，终容积为0.5 ml 。37 ℃预温5 min后加入0.2 mg蛋白质的核，孵育一定时间后加入1 ml 0.2 mol·L-1 MgCl2 终止反应，以0.45 um 微孔滤膜抽滤，滤膜干燥后加入闪烁液，然后测定45Ca2+放射强度。同时做非特异性摄入管，方法同上，但反应体系中不含ATP。核45Ca2+转运等于总摄入量与非特异摄入量之差，以nmol.g Pro-1 表示。
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1.6 统计学处理 结果以均数±标准差(
±s)表示，并采用t 检验作组间比较分析。2 结果
2.1 心肌细胞核得率及标志酶活性 本实验制备的心肌细胞核在显微镜下无细胞碎片污染，核回收率为16.5%，核蛋白质含量较匀浆低38倍，核蛋白质与DNA含量比值9.5，各亚细胞标志酶活性均低于匀浆的5%。
2.2 心肌细胞核钙ATP酶活性变化及Tau对其影响(见表1) 与对照组比较，心肌缺血大鼠心肌匀浆和核内钙含量分别增加43%和48%(P<0.05)，Ca2+-ATPase活性分别降低10.9%和18.1%(P<0.05)；Tau 保护组中核Ca2+-ATPase 活性及Ca2+ 含量未见显著性变化。说明Tau 对缺血心肌细胞核ATPase 活性降低及Ca2+ 含量升高有保护作用，且此作用有剂量依赖关系。
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表1 心肌细胞核钙泵活性及核钙含量变化(
±s,n=10) 组别Ca2+含量mmol.mg Pro-1
Ca2+-ATPase活性/nmol.mg Pro-1.min-1
心肌匀浆
细胞核
心肌匀浆
细胞核
正常对照组
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23.5±4.1
27.9±4.5
25.6±4.7
39.8±3.2
缺血组
33.6±4.8**
41.3±6.2**
22.8±4.2*
32.6±3.0**
T1组100mg.kg-1
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27.1±4.6△
34.1±4.5△
25.1±3.1△
36.6±3.1△
T2组150mg.kg-1
26.3±5.1△
32.5±4.2△
25.9±2.8△
37.1±3.3△
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T3组200mg.kg-1
25.7±5.3△
30.2±4.3△△
26.8±4.5△
38.7±3.5△△
与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与缺血组比较△P<0.05,△△P<0.01
2.3 心肌细胞核45 Ca2+摄取的改变及Tau 的影响(图1) 在ATP存在下，大鼠心肌细胞核45Ca2+摄取具有Ca2+ 浓度依赖性，随Ca2+ 浓度升高而增加，在500 nmol.L-1 范围内呈线性关系，以后逐渐饱和。缺血组心肌细胞核在Ca2+ 各浓度点的45Ca2+摄取量均显著低于正常对照组(P<0.01)，Tau 保护组(200 mg.kg-1 )与对照组比较未见显著性差异(P>0.05)。
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图1 心肌细胞核钙摄取变化
3 讨论
细胞核钙来源于胞浆钙，胞浆Ca2+进入核内不仅通过核孔被动摄取，且在核膜上存在钙泵和IP3受体等核钙主动转运系统[7,8]。Ca2+是胞内重要第二信使，它不仅参与细胞功能代谢的调节，核内钙还参与细胞增殖、发育、分化及细胞凋亡等核功能的调节[1,9]。在心肌衰竭、心肌缺血、心肌梗塞、及缺血再灌注损伤等病理状况下，不但有心功能损伤，而且有心肌质膜、线粒体及肌浆网的钙转运功能障碍，导致胞内钙超载。钙超载是心血管疾病共同发病的重要环节之一[10]。牛磺酸具有调节胞内钙稳态、清除自由基等重要生物学功能，对心血管疾病具有广泛的防治作用[2]。本次实验采用ISO诱导大鼠心肌缺血损伤，观察牛磺酸对心肌缺血损伤时核钙转运系统的影响。所制备的心肌细胞核纯度高，蛋白质比值低，胞内其它亚细胞标志酶活性均低于5%。研究发现，缺血组大鼠心肌细胞核钙泵活性及核膜钙摄取功能均显著低于对照组(P<0.05)，而核内钙含量又显著高于对照组，表明核内Ca2+ 升高可能通过其它途径进入核内。核钙泵活性与核钙摄取功能并不完全一致，也进一步证实核钙转运除钙泵外，还有其它钙转运形式存在。牛磺酸保护组心肌核钙含量及核膜钙泵活性及45Ca2+摄取功能与对照组比较未见显著性差异。可见，牛磺酸对ISO致心肌缺血损伤时核钙转运功能异常有很好的保护作用，该保护作用的病理生理意义值得进一步研究。
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万福生，男，42岁，硕士，副教授，主要从事血管生化及分子生物学研究。
参考文献
1，Allbitton NL,Oancea E,Kuhn Ma, et al.Source of nuclear calcium signals.Proc Natl Acad Sci USA,1994; 91(12):458
2，宿燕岗、杨英珍、陈灏珠.牛磺酸及其在心血管系统疾病中的应用.国外医学心血管疾病分册，1996 ;23(3):138
3，万福生，赵小曼，雷厉.牛磺酸对大鼠心肌缺血损伤的保护.中国药理学通报,1996;12(1):42
4，Nicotera P,Mcconkey DJ,Jones DP, et al.ATP stimulates Ca uptake and increases the free Ca concentration in isolated rat liver nuclei.Pro Natl Acad Sci USA,1989;86:453
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5，Janes LR,Beseech HR.Isolation of canine cardiac sarcolemmal vesicles.Meth pharmacol,1984;5:1
6，Dixon TG,Purdom M.Serum-5'-nucleotidase.J Clin Pathol,1954;7:341
7，Czubryt MP,Ramjia WB,Gilchrist J, et al.The presence and partitioning of calcium binding proteins in hepatic and cardiac nuclei.J Mol Cell Cardiol,1996; 28:455
8，王培勇、汤健、庞永政，等.心肌细胞核上存在钙转运系统.北京医科大学学报,1997;29 (1)：11
9，Trump BE,Berezesky Ik.Calcium mediated cell injury and cell death.FASEB J,1995;9:219
10，Clapham DE.Calcium Signalling.Cell,1995;80:259
收稿日期：1999-12-10
修回日期：2000-02-16, 百拇医药