重组人胰岛素及其相关物质的毛细管区带电泳分析法
作者：廖海明 杨昭鹏 徐康森
单位：廖海明 杨昭鹏 徐康森(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
关键词：毛细管区带电泳；重组人胰岛素；相关物质
药物分析杂志000104 摘 要：目的：建立重组人胰岛素及其相关物质的毛细管区带电泳检测方法。方法：在Beckman 5000型毛细管电泳仪上，采用熔凝石英毛细管柱，以0.05 mol.L-1醋酸钠-0.85 mol.L-1 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈为电极缓冲液，214 nm的检测波长，进行定量分析。结果：线性范围为0.5～50 U.mL-1(r=0.999 5)，回收率(n=3)大于97.0%，RSD小于1.1%，主峰的迁移时间和峰面积的RSD分别为0.12%和0.64%，最小检测限为0.5 μg.mL-1。结论：毛细管区带电泳可以用于重组人胰岛素及其相关物质的定量分析，它具有高效、快速、简便、样品及试剂消耗少等优点。
, 百拇医药
Determination of Recombinant Human Insulin and Its
Related Impurities by Capillary Zone Electrophoresis
Liao Haiming Yang Zhaopeng Xu Kangsen
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Abstract：Objective：To establish a capillary zone electrophoresis(CZE)method for the analysis of recombinant human insulin.Method:On fused silica capillary,using 0.05 mol.L-1 sodium acetate-0.085 mol.L-1 2-(N-cyclohexylamino)ethanesulfonic acid-10% acetonitrile as electrolyts.The wavelength of detection is 214 nm.Results:The linear correlation is observed from the concentrations of 0.5～50 U.mL-1(r＝0.999 5).The recoveries(n=3)are over 97.0% and the RSD values are below 1.1%.RSD of migration time and area of main peak are 0.12% and 0.64%,respectively.Conclusion:CZE can be utilized for the analysis of recombinant human insulin,it has the advantages of accuracy,fastness,convenience,low sample and reagent consumption.
, 百拇医药
Key words：capillary zone electrophoresis,recombinant human insulin,related impurities▲
效价测定是重组人胰岛素质量控制的一项指标。最初的胰岛素效价测定主要采用兔生物测定法[1]。由于反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定的人胰岛素效价与兔生物测定法所得的结果具有一致性[2]，因此目前的重组人胰岛素效价测定主要采用RP-HPLC[3]。
毛细管区带电泳(CZE)作为新兴的分离技术，具有高效、快速、样品及试剂消耗少等优点。本文采用毛细管区带电泳法测定重组人胰岛素，同时进行其相关物质的检查，均得到满意的结果。
1 仪器与试药
Beckman 5000型毛细管电泳仪，固定波长紫外检测器；岛津HPLC系统，包括LC-10AT泵，SPD-10A检测器，CTO-10A柱箱。
, http://www.100md.com
石英毛细管柱(Beckman)，75 μm×57 cm，有效长度50 cm；重组人胰岛素脱氨对照品由Eli Lilly & Company提供，含重组人胰岛素和脱氨重组人胰岛素分别为86%和14%；重组人胰岛素标准品为美国药典标准品，经RP-HPLC检验为一单峰，效价为26.4 U.mg-1；重组人胰岛素原料及注射液由北大和邦生物工程公司提供；2-环己胺基乙磺酸购自Sigma；其余实验试剂均为分析纯。
2 溶液配制
标准品溶液：精密称取重组人胰岛素标准品37.88 mg，置于10 mL容量瓶中，用0.01 mol.L-1盐酸溶解并稀释至刻度，得浓度为50 U.mL-1。
电极缓冲液：称取无水醋酸钠0.41 g，2-环己胺基乙磺酸17.6 g，加入乙腈10 mL，加水50 mL，用三乙胺调pH至7.8，然后加水稀释至100 mL，用0.45 μm滤膜过滤，即得0.05 mol.L-1醋酸钠-0.85 mol.L-1 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈电极缓冲液。
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重组人胰岛素原料溶液：称取重组人胰岛素原料适量，用0.01 mol.L-1盐酸配成1 mg.mL-1供试液。
硫酸盐缓冲液(0.2 mol.L-1，pH 2.3)：称取无水硫酸钠28.4 g，加85%磷酸2.7 mL，加入水800 mL溶解，用乙醇胺调pH至2.3，然后加水至1 000 mL。
流动相：取硫酸盐缓冲液740 mL，加乙腈260 mL，混匀，用0.45 μm滤膜过滤，即得。
3 方法
CZE：每次进样前，依次用0.1 mol.L-1氢氧化钠溶液、电极缓冲液清洗毛细管柱3 min；压力进样6 s，进样后再进5 s电极缓冲液；分离电压16 kV；检测波长214 nm，柱温30 ℃。
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RP-HPLC[4]：Vydac protein and peptide C18柱(25 cm×4.6 mm)；流动相：硫酸盐缓冲液(0.2 mol.L-1，pH 2.3)-乙腈(76∶26)；流速：1.0 mL.min-1；柱温：40 ℃；进样量：25 μL；检测波长：214 nm。
4 线性及灵敏度
精密量取标准品溶液适量，加0.01 mol.L-1盐酸稀释，制成系列溶液，分别进样，以峰面积为纵坐标，以重组人胰岛素效价为横坐标作图。结果表明，重组人胰岛素在0.5～50 U.mL-1的范围内呈良好的线性。回归方程：
Y=0.000 529X+0.017 3 r=0.999 5
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将标准品溶液进行一系列的倍比稀释，然后进行测定，测出信噪比S/N=3时的最低检测浓度为0.5 μg.mL-1。
5 精密度实验
称取含重组人胰岛素和脱氨重组人胰岛素的对照品适量，用0.01 mol.L-1盐酸制成0.5 mg.mL-1的溶液，重复测定6次。对照品中重组人胰岛素迁移时间和峰面积的RSD分别为0.12%和0.64%；脱氨重组人胰岛素迁移时间和峰面积的RSD分别为0.12%和1.62%。
6 样品测定
取3批重组人胰岛素注射液(标示量为40 U.mL-1)，分别用CZE法和RP-HPLC法测定，测定结果见表1，样品分离图谱见图1。由表1看出，CZE与HPLC法测得结果基本一致。
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表1 样品测定结果(标示量%，n=3) 批号
CZE法
RP-HPLC法
970522
98.1(0.76)
97.4(0.42)
970530
97.6(0.72)
97.6(0.22)
970630
98.1(0.36)
98.1(0.33)
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注：括号内为RSD(%)
7 回收率
精密量取已测知含量的3批重组人胰岛素注射液(970522，970530，970630)2.50 mL，加入标准品溶液0.20 mL，用0.01 mol.L-1 盐酸稀释至5.00 mL,分别进样，记录毛细管电泳图谱，计算回收率，3批重组人胰岛素注射液的回收率均大于97.0%，RSD小于1.1%，n=3。
图1 样品的毛细管电泳图谱
1.苯酚 2.胰岛素 3.相关物质
8 相关物质检测
取重组人胰岛素原料溶液和注射液，用CZE法分析，用峰面积归一化法计算相关物质含量。结果见表2。表2的结果表明，在重组人胰岛素相关物质的分析中，CZE法与RP-HPLC法是基本一致的。
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表2 样品相关物质含量测定结果(%，n＝3) 样品
CZE法
RP-HPLC法
胰岛素
相关物质
胰岛素
相关物质
原料(970501)
98.51
1.49
98.59
1.41
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原料(970502)
98.53
1.47
98.52
1.48
原料(970601)
98.47
1.53
98.40
1.60
制剂(970522)
93.48
, http://www.100md.com 6.52
93.46
6.54
制剂(970530)
92.58
7.42
92.63
7.37
制剂(970603)
92.52
7.48
92.54
7.46
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9 讨论
毛细管区带电泳的分离是以电场中溶质的迁移速度的差异为基础的。缓冲液的pH影响胰岛素及其相关物质所带电荷数量，从而影响其迁移速度。本实验考察pH 2.5～8.0条件下的迁移速度变化，其中在pH 7.8时，胰岛素与其相关物质获得最大的分离。
蛋白质在毛细管内壁吸附主要是由毛细管内壁的静电引力和疏水作用[5]造成的。通常这种吸附是不可逆的，它将造成样品回收率降低，基线不稳定，结果的重复性变差，定性定量困难等一系列危害。本实验比较了0.05 mol.L-1磷酸盐(pH 7.8)和0.05 mol.L-1醋酸钠-0.85 mol.L-1 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈(pH 7.8)电极缓冲液对蛋白质在毛细管内壁吸附的影响，结果表明，高浓度的0.05 mol.L-1醋酸钠-0.85 mol.L-1 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈(pH 7.8)电极缓冲液能有效地消除毛细管内壁吸附对定量分离的影响，改善峰形，提高重现性和准确度。■
, 百拇医药
参考文献：
[1]USP.Ⅹ Ⅺ.1180
[2]Farid AN,Atkins ML,Becker WG.Liquid chromatographic control of the identity,purity and potency of biomolecules used as drugs.J Pharm Biomed Anal,1989,7(2):185
[3]USP.Ⅹ Ⅹ Ⅲ.810
[4]李湛君，杨昭鹏，徐康森.重组人胰岛素效价测定中生物测定与理化测定的相关性验证.药物分析杂志，1998，18(4)：241
[5]刘玉，傅若农.毛细管电泳中消除和控制吸附的进展.国外仪器分析，1993，3(1)：1
收稿日期：1998-12-29, http://www.100md.com
单位：廖海明 杨昭鹏 徐康森(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
关键词：毛细管区带电泳；重组人胰岛素；相关物质
药物分析杂志000104 摘 要：目的：建立重组人胰岛素及其相关物质的毛细管区带电泳检测方法。方法：在Beckman 5000型毛细管电泳仪上，采用熔凝石英毛细管柱，以0.05 mol.L-1醋酸钠-0.85 mol.L-1 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈为电极缓冲液，214 nm的检测波长，进行定量分析。结果：线性范围为0.5～50 U.mL-1(r=0.999 5)，回收率(n=3)大于97.0%，RSD小于1.1%，主峰的迁移时间和峰面积的RSD分别为0.12%和0.64%，最小检测限为0.5 μg.mL-1。结论：毛细管区带电泳可以用于重组人胰岛素及其相关物质的定量分析，它具有高效、快速、简便、样品及试剂消耗少等优点。
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Determination of Recombinant Human Insulin and Its
Related Impurities by Capillary Zone Electrophoresis
Liao Haiming Yang Zhaopeng Xu Kangsen
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Abstract：Objective：To establish a capillary zone electrophoresis(CZE)method for the analysis of recombinant human insulin.Method:On fused silica capillary,using 0.05 mol.L-1 sodium acetate-0.085 mol.L-1 2-(N-cyclohexylamino)ethanesulfonic acid-10% acetonitrile as electrolyts.The wavelength of detection is 214 nm.Results:The linear correlation is observed from the concentrations of 0.5～50 U.mL-1(r＝0.999 5).The recoveries(n=3)are over 97.0% and the RSD values are below 1.1%.RSD of migration time and area of main peak are 0.12% and 0.64%,respectively.Conclusion:CZE can be utilized for the analysis of recombinant human insulin,it has the advantages of accuracy,fastness,convenience,low sample and reagent consumption.
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Key words：capillary zone electrophoresis,recombinant human insulin,related impurities▲
效价测定是重组人胰岛素质量控制的一项指标。最初的胰岛素效价测定主要采用兔生物测定法[1]。由于反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定的人胰岛素效价与兔生物测定法所得的结果具有一致性[2]，因此目前的重组人胰岛素效价测定主要采用RP-HPLC[3]。
毛细管区带电泳(CZE)作为新兴的分离技术，具有高效、快速、样品及试剂消耗少等优点。本文采用毛细管区带电泳法测定重组人胰岛素，同时进行其相关物质的检查，均得到满意的结果。
1 仪器与试药
Beckman 5000型毛细管电泳仪，固定波长紫外检测器；岛津HPLC系统，包括LC-10AT泵，SPD-10A检测器，CTO-10A柱箱。
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石英毛细管柱(Beckman)，75 μm×57 cm，有效长度50 cm；重组人胰岛素脱氨对照品由Eli Lilly & Company提供，含重组人胰岛素和脱氨重组人胰岛素分别为86%和14%；重组人胰岛素标准品为美国药典标准品，经RP-HPLC检验为一单峰，效价为26.4 U.mg-1；重组人胰岛素原料及注射液由北大和邦生物工程公司提供；2-环己胺基乙磺酸购自Sigma；其余实验试剂均为分析纯。
2 溶液配制
标准品溶液：精密称取重组人胰岛素标准品37.88 mg，置于10 mL容量瓶中，用0.01 mol.L-1盐酸溶解并稀释至刻度，得浓度为50 U.mL-1。
电极缓冲液：称取无水醋酸钠0.41 g，2-环己胺基乙磺酸17.6 g，加入乙腈10 mL，加水50 mL，用三乙胺调pH至7.8，然后加水稀释至100 mL，用0.45 μm滤膜过滤，即得0.05 mol.L-1醋酸钠-0.85 mol.L-1 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈电极缓冲液。
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重组人胰岛素原料溶液：称取重组人胰岛素原料适量，用0.01 mol.L-1盐酸配成1 mg.mL-1供试液。
硫酸盐缓冲液(0.2 mol.L-1，pH 2.3)：称取无水硫酸钠28.4 g，加85%磷酸2.7 mL，加入水800 mL溶解，用乙醇胺调pH至2.3，然后加水至1 000 mL。
流动相：取硫酸盐缓冲液740 mL，加乙腈260 mL，混匀，用0.45 μm滤膜过滤，即得。
3 方法
CZE：每次进样前，依次用0.1 mol.L-1氢氧化钠溶液、电极缓冲液清洗毛细管柱3 min；压力进样6 s，进样后再进5 s电极缓冲液；分离电压16 kV；检测波长214 nm，柱温30 ℃。
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RP-HPLC[4]：Vydac protein and peptide C18柱(25 cm×4.6 mm)；流动相：硫酸盐缓冲液(0.2 mol.L-1，pH 2.3)-乙腈(76∶26)；流速：1.0 mL.min-1；柱温：40 ℃；进样量：25 μL；检测波长：214 nm。
4 线性及灵敏度
精密量取标准品溶液适量，加0.01 mol.L-1盐酸稀释，制成系列溶液，分别进样，以峰面积为纵坐标，以重组人胰岛素效价为横坐标作图。结果表明，重组人胰岛素在0.5～50 U.mL-1的范围内呈良好的线性。回归方程：
Y=0.000 529X+0.017 3 r=0.999 5
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将标准品溶液进行一系列的倍比稀释，然后进行测定，测出信噪比S/N=3时的最低检测浓度为0.5 μg.mL-1。
5 精密度实验
称取含重组人胰岛素和脱氨重组人胰岛素的对照品适量，用0.01 mol.L-1盐酸制成0.5 mg.mL-1的溶液，重复测定6次。对照品中重组人胰岛素迁移时间和峰面积的RSD分别为0.12%和0.64%；脱氨重组人胰岛素迁移时间和峰面积的RSD分别为0.12%和1.62%。
6 样品测定
取3批重组人胰岛素注射液(标示量为40 U.mL-1)，分别用CZE法和RP-HPLC法测定，测定结果见表1，样品分离图谱见图1。由表1看出，CZE与HPLC法测得结果基本一致。
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表1 样品测定结果(标示量%，n=3) 批号
CZE法
RP-HPLC法
970522
98.1(0.76)
97.4(0.42)
970530
97.6(0.72)
97.6(0.22)
970630
98.1(0.36)
98.1(0.33)
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注：括号内为RSD(%)
7 回收率
精密量取已测知含量的3批重组人胰岛素注射液(970522，970530，970630)2.50 mL，加入标准品溶液0.20 mL，用0.01 mol.L-1 盐酸稀释至5.00 mL,分别进样，记录毛细管电泳图谱，计算回收率，3批重组人胰岛素注射液的回收率均大于97.0%，RSD小于1.1%，n=3。
图1 样品的毛细管电泳图谱
1.苯酚 2.胰岛素 3.相关物质
8 相关物质检测
取重组人胰岛素原料溶液和注射液，用CZE法分析，用峰面积归一化法计算相关物质含量。结果见表2。表2的结果表明，在重组人胰岛素相关物质的分析中，CZE法与RP-HPLC法是基本一致的。
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表2 样品相关物质含量测定结果(%，n＝3) 样品
CZE法
RP-HPLC法
胰岛素
相关物质
胰岛素
相关物质
原料(970501)
98.51
1.49
98.59
1.41
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原料(970502)
98.53
1.47
98.52
1.48
原料(970601)
98.47
1.53
98.40
1.60
制剂(970522)
93.48
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93.46
6.54
制剂(970530)
92.58
7.42
92.63
7.37
制剂(970603)
92.52
7.48
92.54
7.46
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9 讨论
毛细管区带电泳的分离是以电场中溶质的迁移速度的差异为基础的。缓冲液的pH影响胰岛素及其相关物质所带电荷数量，从而影响其迁移速度。本实验考察pH 2.5～8.0条件下的迁移速度变化，其中在pH 7.8时，胰岛素与其相关物质获得最大的分离。
蛋白质在毛细管内壁吸附主要是由毛细管内壁的静电引力和疏水作用[5]造成的。通常这种吸附是不可逆的，它将造成样品回收率降低，基线不稳定，结果的重复性变差，定性定量困难等一系列危害。本实验比较了0.05 mol.L-1磷酸盐(pH 7.8)和0.05 mol.L-1醋酸钠-0.85 mol.L-1 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈(pH 7.8)电极缓冲液对蛋白质在毛细管内壁吸附的影响，结果表明，高浓度的0.05 mol.L-1醋酸钠-0.85 mol.L-1 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈(pH 7.8)电极缓冲液能有效地消除毛细管内壁吸附对定量分离的影响，改善峰形，提高重现性和准确度。■
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参考文献：
[1]USP.Ⅹ Ⅺ.1180
[2]Farid AN,Atkins ML,Becker WG.Liquid chromatographic control of the identity,purity and potency of biomolecules used as drugs.J Pharm Biomed Anal,1989,7(2):185
[3]USP.Ⅹ Ⅹ Ⅲ.810
[4]李湛君，杨昭鹏，徐康森.重组人胰岛素效价测定中生物测定与理化测定的相关性验证.药物分析杂志，1998，18(4)：241
[5]刘玉，傅若农.毛细管电泳中消除和控制吸附的进展.国外仪器分析，1993，3(1)：1
收稿日期：1998-12-29, http://www.100md.com