AKP-PEI-HBV-DNA探针的制备及应用
作者：黄果勇 潘海东 周开姣 葛宪民
单位：广西壮族自治区卫生防疫站 南宁530021
关键词：AKP-PEI；HBV；DNA探针
广西预防医学000112
[摘要]目的制备具有快速、简便、特异、灵敏的HBV-DNA探针。方法用AKP-PBO-PEI复合物，通过戊二醛与HBV-DNA共价结合制备AKP-HBV-DNA探针，杂交后用NBT和BCIP染色观察结果。结果本法制备的探针可测出5pg的HBV-DNA，有较高的稳定性及重复性，同时与Dig标记的HBV-DNA探针进行66份血清标本检测比较，优于Dig探针。结论本法具有快速`简便`特异`灵敏(5pg)等优点，适用于基层推广使用。
中图分类号：R373.2+1文献标识码：A文章编号：1007-158X(2000)01-0032-02
, 百拇医药
尽管PCR法检测HBV-DNA已在国内外广为应用，但由于需要昂贵的仪器而使基层单位至今尚无法开展，因此，我们根据Renz[1]和Jablonsk[2]等法建立了一种直接连接酶与核酸制备酶标记HBV_DNA探针的分子杂交法，该法具有特异、敏感、快速等优点。
1材料与方法
1.1HBV-DNA的制备 由中国预防医学科学院病毒学研究所和中山医科大学提供HBV质粒DNA，经ECORI内切酶处理，低溶点琼脂糖凝胶电泳获纯化的HBV_DNA。
1.2标记试剂的制备 AKP_PEI结合物由3mg碱性磷酸酶(AKP，Sigma，RZ≥3.0)在0.1MPB，PH6.04℃透析过夜，加上90ml的对苯醌(PBO)置暗处37℃1小时，AKP_PBO经SephadexG-75层析柱(20ml柱体积，用0.15MNaCl洗脱)纯化去除非反应的对苯醌。用1MNaHCO3调PH至9.5，加入20μl聚乙烯亚胺(PEI，BDH，England)，混匀后置暗处37℃18小时孵育在5mMPB，PH6.84℃透析过夜，收集酶结合物，即为标记试剂，浓度约为2μg/μl，4℃或-20℃存放。
, 百拇医药
1.3AKP_PEI_HBV_DNA探针的制备 取纯化的HBV_DNA100ng/μl(盐浓度≤100mmol)置EP管中，煮沸5′，冰浴5′，加10μl标记试剂，混匀再加10μl5%的戊二醛溶液置37℃孵育10′，加50%甘油置-20℃保存或立即使用。
1.4检测方法 将已知的HBV_DNA，鱼精DNA和待检血清中HBV_DNA固定在阳离子尼龙膜上(Hybond_n+，Amersham)，装入杂交袋在40～42℃水浴中预杂交1.5小时并加酶标记HBV_DNA探针，40～42℃水浴杂交1.5小时。取出尼龙膜进行漂洗，再放入盛有15ml的氮蓝四唑(NBT5mg)和5_溴_4_氯_3_吲哚磷酸盐(BCIP2.5mg)，50μl二甲基酰胺溶液中显色，用100mMTris_HClPH7.4，5mMEDTA终止，以测试该探针的特异性及血清中的HBV_DNA。66份待检血清来自南宁市第四医院肝炎病人，同时与购自中国预科院病毒学研究所地高辛标记探针试剂盒进行测试比较。
, 百拇医药 2结果
2.1特异性及灵敏度测定 将纯化的HBV_DNA作系列稀释和大肠杆菌质粒PBR322DNA及鱼精DNA作为对照，同时点样检测，前者可测出5pg，后两种在各条件下测试未能检出阳性结果。
2.2稳定性及重复性 制备好的探针加50%甘油分装置-20℃和4℃保存，于第3、6、9、12个月取出同前条件分别与已系列稀释的HBV_DNA和鱼精DNA杂交测试两次，结果4℃保存的探针在第12个月两次测试均测到5Pg的HBV_DNA，而存于-20℃的探针在第9个月与已知的HBV_DNA杂交的两次测试仅隐约可见5Pg斑点，至第12个月时仅能测到10Pg的HBV_DNA。说明该探针置-20℃可保存半年以上，冻存温度低时间长，其灵敏度有所下降；置4℃可保存10个月以上，经反复测试已知HBV_DNA，表明该探针有较高的稳定性和重复性以及方便保存，适于无低温保存探针的基层单位应用。
2.3应用效果 我们用本法制备的探针(E)和地高辛标记的探针(Dig)分别与南宁市第四医院送检的肝炎病人血清66份进行杂交，测定其中的HBV-DNA，结果两探针杂交均为阳性者49份，阴性者为14份，E探针阳性而Dig探针阴性者3份，这3份血清后来经PCR法测定显示强阳性带，确证了E探针显示为阳性的这3份血清存在HBV-DNA的真实性。两探针测定结果的总符合率为95%，两者无显著性差异(P>0.05)。
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3讨论
通过检测66份肝炎病人血清所获结果，E探针的灵敏度和特异性优于Dig探针，而且制备探针和检测方法快速、简便，优于地高辛标记探针的检测方法。国外报道能测到单拷贝基因或1～5pg和0.5～5pg[2]。在本探针能测到5pg，如果杂交温度能控制在40～41℃，AKP_DNA探针用低盐溶液(<10mM) ， 底物溶液中含PEG(6%)，并用发光系统曝光可测到2pg。在实验室检测中，最好将阻断试剂和标记探针溶液分装，一次用完或存于-20℃，我们将分装后余下的探针置-80℃15个月时试图用于其他研究的测试比较，结果仅测出100pg的HBV_DNA，冻存温度过低可能会影响酶探针的效果。本法从标记至检测样品时间大大缩短，预杂交和杂交时间可分别缩短到45分钟，具有简便快速经济及较高的特异性和敏感性。我们曾用NaOH-甲醛预处理血清，在预杂交时加入变性的鱼精DNA、PVP和SDS，可得到强的杂交信号，提高灵敏度和特异性，而不会增加非特异性杂交。这是由于(1)用盐、NaOH、甲醛和去污剂混合物作为变性剂较单纯用NaOH或煮沸变性更有效；(2)避免大量DNA穿透点样膜；(3)节省或略去蛋白酶K的处理，而能收到更好的效果。<10mM)，底物溶液中含PEG(6%)，并用发光系统曝光可测到2pg。在实验室检测中，最好将阻断试剂和标记探针溶液分装，一次用完或存于-20℃，我们将分装后余下的探针置-80℃15个月时试图用于其他研究的测试比较，结果仅测出100pg的HBV_DNA，冻存温度过低可能会影响酶探针的效果。本法从标记至检测样品时间大大缩短，预杂交和杂交时间可分别缩短到45分钟，具有简便快速经济及较高的特异性和敏感性。我们曾用NaOH-甲醛预处理血清，在预杂交时加入变性的鱼精DNA、PVP和SDS，可得到强的杂交信号，提高灵敏度和特异性，而不会增加非特异性杂交。这是由于(1)用盐、NaOH、甲醛和去污剂混合物作为变性剂较单纯用NaOH或煮沸变性更有效；(2)避免大量DNA穿透点样膜；(3)节省或略去蛋白酶K的处理，而能收到更好的效果。
, 百拇医药
作者简介：黄果勇(1957-)，男(壮族)，广西田阳县人。广西壮族自治区卫生防疫站副主任医师，主要从事肝炎防治及实验动物模型研究。
参考文献
1，Ronz M. and Kurz C A. colorimetric method for DNA hybridization[J]. Nucleic Acids Research， 1984， 12( 8) ： 3435- 3444
2，Jablonski E， et al.Preparation of oligodeoxynu_ cleotide_alkaline phosphatase conjugates and their use as hybridization probe[J]. Nucleic Acids Research,1986,14( 15) ： 6115- 6128
(1999-08-24收稿。1999-10-25修回。), 百拇医药
单位：广西壮族自治区卫生防疫站 南宁530021
关键词：AKP-PEI；HBV；DNA探针
广西预防医学000112
[摘要]目的制备具有快速、简便、特异、灵敏的HBV-DNA探针。方法用AKP-PBO-PEI复合物，通过戊二醛与HBV-DNA共价结合制备AKP-HBV-DNA探针，杂交后用NBT和BCIP染色观察结果。结果本法制备的探针可测出5pg的HBV-DNA，有较高的稳定性及重复性，同时与Dig标记的HBV-DNA探针进行66份血清标本检测比较，优于Dig探针。结论本法具有快速`简便`特异`灵敏(5pg)等优点，适用于基层推广使用。
中图分类号：R373.2+1文献标识码：A文章编号：1007-158X(2000)01-0032-02
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尽管PCR法检测HBV-DNA已在国内外广为应用，但由于需要昂贵的仪器而使基层单位至今尚无法开展，因此，我们根据Renz[1]和Jablonsk[2]等法建立了一种直接连接酶与核酸制备酶标记HBV_DNA探针的分子杂交法，该法具有特异、敏感、快速等优点。
1材料与方法
1.1HBV-DNA的制备 由中国预防医学科学院病毒学研究所和中山医科大学提供HBV质粒DNA，经ECORI内切酶处理，低溶点琼脂糖凝胶电泳获纯化的HBV_DNA。
1.2标记试剂的制备 AKP_PEI结合物由3mg碱性磷酸酶(AKP，Sigma，RZ≥3.0)在0.1MPB，PH6.04℃透析过夜，加上90ml的对苯醌(PBO)置暗处37℃1小时，AKP_PBO经SephadexG-75层析柱(20ml柱体积，用0.15MNaCl洗脱)纯化去除非反应的对苯醌。用1MNaHCO3调PH至9.5，加入20μl聚乙烯亚胺(PEI，BDH，England)，混匀后置暗处37℃18小时孵育在5mMPB，PH6.84℃透析过夜，收集酶结合物，即为标记试剂，浓度约为2μg/μl，4℃或-20℃存放。
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1.3AKP_PEI_HBV_DNA探针的制备 取纯化的HBV_DNA100ng/μl(盐浓度≤100mmol)置EP管中，煮沸5′，冰浴5′，加10μl标记试剂，混匀再加10μl5%的戊二醛溶液置37℃孵育10′，加50%甘油置-20℃保存或立即使用。
1.4检测方法 将已知的HBV_DNA，鱼精DNA和待检血清中HBV_DNA固定在阳离子尼龙膜上(Hybond_n+，Amersham)，装入杂交袋在40～42℃水浴中预杂交1.5小时并加酶标记HBV_DNA探针，40～42℃水浴杂交1.5小时。取出尼龙膜进行漂洗，再放入盛有15ml的氮蓝四唑(NBT5mg)和5_溴_4_氯_3_吲哚磷酸盐(BCIP2.5mg)，50μl二甲基酰胺溶液中显色，用100mMTris_HClPH7.4，5mMEDTA终止，以测试该探针的特异性及血清中的HBV_DNA。66份待检血清来自南宁市第四医院肝炎病人，同时与购自中国预科院病毒学研究所地高辛标记探针试剂盒进行测试比较。
, 百拇医药 2结果
2.1特异性及灵敏度测定 将纯化的HBV_DNA作系列稀释和大肠杆菌质粒PBR322DNA及鱼精DNA作为对照，同时点样检测，前者可测出5pg，后两种在各条件下测试未能检出阳性结果。
2.2稳定性及重复性 制备好的探针加50%甘油分装置-20℃和4℃保存，于第3、6、9、12个月取出同前条件分别与已系列稀释的HBV_DNA和鱼精DNA杂交测试两次，结果4℃保存的探针在第12个月两次测试均测到5Pg的HBV_DNA，而存于-20℃的探针在第9个月与已知的HBV_DNA杂交的两次测试仅隐约可见5Pg斑点，至第12个月时仅能测到10Pg的HBV_DNA。说明该探针置-20℃可保存半年以上，冻存温度低时间长，其灵敏度有所下降；置4℃可保存10个月以上，经反复测试已知HBV_DNA，表明该探针有较高的稳定性和重复性以及方便保存，适于无低温保存探针的基层单位应用。
2.3应用效果 我们用本法制备的探针(E)和地高辛标记的探针(Dig)分别与南宁市第四医院送检的肝炎病人血清66份进行杂交，测定其中的HBV-DNA，结果两探针杂交均为阳性者49份，阴性者为14份，E探针阳性而Dig探针阴性者3份，这3份血清后来经PCR法测定显示强阳性带，确证了E探针显示为阳性的这3份血清存在HBV-DNA的真实性。两探针测定结果的总符合率为95%，两者无显著性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
3讨论
通过检测66份肝炎病人血清所获结果，E探针的灵敏度和特异性优于Dig探针，而且制备探针和检测方法快速、简便，优于地高辛标记探针的检测方法。国外报道能测到单拷贝基因或1～5pg和0.5～5pg[2]。在本探针能测到5pg，如果杂交温度能控制在40～41℃，AKP_DNA探针用低盐溶液(<10mM) ， 底物溶液中含PEG(6%)，并用发光系统曝光可测到2pg。在实验室检测中，最好将阻断试剂和标记探针溶液分装，一次用完或存于-20℃，我们将分装后余下的探针置-80℃15个月时试图用于其他研究的测试比较，结果仅测出100pg的HBV_DNA，冻存温度过低可能会影响酶探针的效果。本法从标记至检测样品时间大大缩短，预杂交和杂交时间可分别缩短到45分钟，具有简便快速经济及较高的特异性和敏感性。我们曾用NaOH-甲醛预处理血清，在预杂交时加入变性的鱼精DNA、PVP和SDS，可得到强的杂交信号，提高灵敏度和特异性，而不会增加非特异性杂交。这是由于(1)用盐、NaOH、甲醛和去污剂混合物作为变性剂较单纯用NaOH或煮沸变性更有效；(2)避免大量DNA穿透点样膜；(3)节省或略去蛋白酶K的处理，而能收到更好的效果。<10mM)，底物溶液中含PEG(6%)，并用发光系统曝光可测到2pg。在实验室检测中，最好将阻断试剂和标记探针溶液分装，一次用完或存于-20℃，我们将分装后余下的探针置-80℃15个月时试图用于其他研究的测试比较，结果仅测出100pg的HBV_DNA，冻存温度过低可能会影响酶探针的效果。本法从标记至检测样品时间大大缩短，预杂交和杂交时间可分别缩短到45分钟，具有简便快速经济及较高的特异性和敏感性。我们曾用NaOH-甲醛预处理血清，在预杂交时加入变性的鱼精DNA、PVP和SDS，可得到强的杂交信号，提高灵敏度和特异性，而不会增加非特异性杂交。这是由于(1)用盐、NaOH、甲醛和去污剂混合物作为变性剂较单纯用NaOH或煮沸变性更有效；(2)避免大量DNA穿透点样膜；(3)节省或略去蛋白酶K的处理，而能收到更好的效果。
, 百拇医药
作者简介：黄果勇(1957-)，男(壮族)，广西田阳县人。广西壮族自治区卫生防疫站副主任医师，主要从事肝炎防治及实验动物模型研究。
参考文献
1，Ronz M. and Kurz C A. colorimetric method for DNA hybridization[J]. Nucleic Acids Research， 1984， 12( 8) ： 3435- 3444
2，Jablonski E， et al.Preparation of oligodeoxynu_ cleotide_alkaline phosphatase conjugates and their use as hybridization probe[J]. Nucleic Acids Research,1986,14( 15) ： 6115- 6128
(1999-08-24收稿。1999-10-25修回。), 百拇医药