卡氏肺孢子虫肺炎动物模型的建立及其检测
作者：颜苹苹 严延生 何似
单位：颜苹苹(福建省流行病研究所， 福建 福州 350001)；严延生(福建省流行病研究所， 福建 福州 350001)；何似(福建省流行病研究所， 福建 福州 350001)
关键词：卡氏肺孢子虫肺炎；动物模型
疾病控制杂志000126
【摘 要】 目的 为开展人卡氏肺孢子虫的病原学形态观察、免疫化学、分子生物学特性以及药物治疗的研究建立卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型。方法 给SD大鼠腹股沟皮下注射醋酸可的松，6～12周后，收集支气管肺泡灌洗液和制作肺组织印片，组化染色，镜下观察。结果 实验大鼠的肺印片肺孢子虫病原学染色阳性率为96%(24/25)，在24只肺孢子虫病原学染色检查阳性的大鼠中，11只大鼠BALs沉淀涂片阳性。本次诱导实验包囊检出时间最早的为用药40天，且随用药时间的延长，感染程度逐渐加重。对照组均未检出阳性。结论 建立了卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型。
, 百拇医药
【分类号】 S865.1； R392 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(2000)01-0067-02
Establishment and detection of pneumocystis carinii pneumonia rat model
YAN Ping-ping YAN Yan-sheng HE Shi
(Fujian Provincial Epidemiology Research Institute, Fuzhou 350001, China)
【Abstract】 Objective To establish pneumocystis carinii penumonia(PCP) rat model and detect human PCP. Methods SD rats were immunosuppressed with biweekly injection of cortisone acetate (25 mg) for 6～12 weeks and then killed. The development of P. carinii lung infection was monitored through giemsa, Weigert-Giemsa and Chalvardjian's toluidine blue-O stainings of lung imprints and brochial aloveolar lavage fluids (BALFs). Results P. Carinii was observed in 24 of 25 experimental SD rats in lung imprints, among which 11 were positive in BALFs. Conclusions SD rat model of PCP has been successfully developed in our experiment. And the induction rate is similar to those reported abroad and higher than results of some domestic reports and has achieved our prospective.
, 百拇医药
【Key words】 pneumocystis carinii pneumonia(PCP); rat model
卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocystis Carinii Pneumonia, PCP)已成为AIDS病人和其他免疫缺陷者最常见的、严重的机会性感染。该病临床病情重，缺乏相应体征，且易迅速恶化，未经及时诊治，病死率可高达20%～60%。早期诊断、及时采用针对性的治疗是减低病死率，改善预后的关键。鉴于鼠的卡氏肺孢子虫与人的卡氏肺孢子虫之间病原学形态、核酸和抗原等方面存在的共性，本文通过建立大鼠PCP模型，旨在加深对该病的认识，为开展人卡氏肺孢子虫的病原学形态观察、免疫化学、分子生物学特性以及药物治疗的研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 健康的Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，雌性，体重为150～170 g，上海动物公司提供。低蛋白含量大鼠饲料(8%)，福建省实验动物研究中心配制。醋酸可的松每瓶125 mg，上海第九制药厂生产；四环素片每片25万单位，武汉第四制药厂生产。
, 百拇医药
1.2 PCP诱导方式 随机将动物分成实验组、对照组。实验组每笼4只，共7笼，对照组2只。实验组给大鼠腹股沟皮下注射醋酸可的松每只25 mg，每周两次，同时饮水中加入四环素1 g*L-1，以预防细菌性感染。对照组不给药。
1.3 动物解剖及标本采集 6～12周后陆续剖杀大鼠。无菌分离并部分横断切开气管，插入连接有5 ml注射器(内装生理盐水)、粗细适宜的塑料导管，并加以固定。通过注射器行支气管肺泡灌洗(brochial aloveolar lavage fluids. BALs)，连续7～8次，回收30～40 ml的支气管肺泡灌洗液。2 000 rpm离心10 min，弃去上清液，取少量沉淀涂片。生理盐水洗净肺脏表面血液，切开肺脏各叶，制成肺组织印片，BALs沉淀、肺组织冻存在-20℃。
1.4 病原学染色、镜检 姬姆萨染色：肺组织印片和肺内灌洗液涂片先经甲醇固定2 min，然后用pH 6.8～7.2磷酸盐缓冲液(PBS)按1∶20稀释姬姆萨原液制成染液，染色2 h，油镜下观察。瑞-姬姆萨染色：将瑞-姬姆萨染色液(1.0 g瑞氏染料和0.5 g姬姆萨染料深于500 ml甲醇配制而成)直接滴加在印片或涂片上，进行染色5～10 min，油镜下观察[1]。亚甲胺兰染色：将0.1%亚甲胺兰染色滴加在印片或涂片上，进行染色5～20 min，油镜下观察。
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2 结果
2.1 一般状况
2.1.1 对照组 大鼠情况良好，体毛色泽光亮，活动、摄食良好。实验开始时平均体重为(159.06±13.43) g，第6周(226.50±13.43) g，增加约42%，动物均健康存活。
2.1.2 实验组 大鼠用药第2周后，体重不升或开始下降。实验开始时平均体重为(156.89±6.39) g，第6周存活鼠体重为(118.76±10.25) g，体重减少约32%。动物活动及摄食减少，挤在鼠笼的角落、萎糜、逐渐消瘦，出现斑片状脱毛、毛色晦暗无光泽，眼球从透亮的红色变暗、眼圈发紫、呼吸急促，最后多因衰竭、呼吸极度困难而死亡。
2.1.3 感染阳性率 SD大鼠30只，其中2只作为正常对照，不注射药物，28只作为实验组给药。实验大鼠于第27、30、31日各死亡1只，未作病原学检查，以上3只从实验组中剔除。其余27只继续用药第6周，开始陆续剖杀大鼠。25只中24只实验大鼠的肺印片肺孢子虫病原学染色检查均为阳性，阳性率为96%(24/25)。在24只肺孢子虫病原学染色检查阳性的大鼠中，11只大鼠BALs沉淀涂片阳性。本次诱导实验包囊检出时间最早的为用药40天，且随用药时间的延长，感染程度逐渐加重。对照组均未检出阳性。
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2.2 病原学染色特征 姬姆萨染色：包囊囊壁不着色，囊内可见呈紫红色的2～8个囊内小体，排列成团状。瑞-姬姆萨染色：镜下观察的结果与姬姆萨染色基本一致。亚甲胺兰染色：包囊囊壁呈紫蓝色，圆形或椭圆形，囊内小体不着色。
3 讨论
卡氏肺孢子虫感染是呼吸道一种严重的机会感染性疾病，20世纪50年代初，本病仅见于早产儿、营养不良儿，随着器官移植、肿瘤化疗的发展，免疫抑制剂和糖皮质激素的广泛应用，获得性免疫缺陷综合征的出现和流行，PCP的发病率剧增。
我省自1987年发现首例艾滋病以来，目前发现的艾滋病病毒感染者/艾滋病病人超过百例，艾滋病病人三十多例，他们大部分有呼吸道感染的表现，但是由于缺乏有效的检测手段，均未能明确诊断，影响采取及时的对症治疗。根据鼠的卡氏肺孢子虫与人的卡氏肺孢子虫之间在病原学形态、DNA及抗原性存在的共性，本文探讨大鼠PCP模型的建立，为开展人卡氏肺孢子虫的病原学形态观察、免疫化学、生物学特性及分子生物学的研究奠定基础。建立动物模型机理是基于当各种原因造成机体免疫功能低下时，潜伏状态的卡氏肺孢子虫将大量生长繁殖，形成“潜伏状态再激活”，引起病理改变和临床症状。报道中，用于诱导动物模型的动物有大鼠、BALB/C小鼠[2～4]和新西兰白兔[5]、猪[6]等，但以大鼠最为常用。国内多采用Wistar大鼠，而国外多采用SD大鼠。动物的诱导方式主要有两种：使用糖皮质激素或抗CD4单克隆抗体[7]。糖皮质激素的使用可以口服(将糖皮质激素加在动物的饮水中，让其自行饮用)，也可以皮下注射，但以皮下注射诱导的成功率较高。口服药物有醋酸地塞米松(1.5～2.0 ml*L-1)或强的松龙100 ml*L-1，注射常用药物有醋酸可的松每次25 ml或氢化可的松25 ml，每周2次，共进行6～12周。考虑到SD大鼠性情较Wistar大鼠温和，便于饲养、管理和给药，而且也与国外的方法接轨，本次研究采用SD大鼠。为了保证实验的诱导效率，采用了皮下注射醋酸可的松的方法，取得了较满意的结果，感染阳性率为96%，与国外的报道相似，较某些国内报道高。
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在病原学检测方面，采用三种不同的染色方法，姬姆萨染色与瑞-姬姆萨染色和亚甲胺兰染色，其中前两者是染卡氏肺孢子虫的囊内小体，后者是染囊壁，联合使用不同机理染色方法的目的是提高诊断率和检测的准确性。实验中我们注意到姬姆萨染色与瑞-姬姆萨染色的效果相似，但是瑞-姬姆萨染色较姬姆萨染色简便、耗时少，可以考虑作为病原形态学的快速诊断方法。为了进一步提高检测的敏感性和特异性，国外已有采用分子生物学手段检测卡氏肺孢子虫DNA的报道，这也将是我们进一步要开展的工作。
【作者简介】 颜苹苹(1965-)，女，福建晋江人，主管医师，硕士，1997年赴英国留学，获英国伦敦泌尿生殖医学证书(Diploma in GU Medicine)
【参考文献】
[1]瞿介明，何礼贤，李锡莹，等. 卡氏肺孢子虫快速染色法 [J]. 上海医科大学学报，1994，21(4)：275～277.
, 百拇医药
[2]Evans R, Joss AW, Pennington TH, et al. Progression of Pneumocystis carinii infection in an animal model [J]. J Med Microbiol, 1998,47(6):543～546.
[3]Boylan CJ, Current WL. Improved rat model of Pneumocystis carinii pneumonia: induced laboratory infections in Pneumocystis-free animals [J]. Infect Immun, 1992,60(4):1589～1597.
[4]McFadden DC, Powles MA, Pittarelli LA AU, et al. Establishment of Pneumocystis carinii in various mouse strains using natural transmission to initiate infection [J]. J Antimicrob Chemother, 1995,36(1):137～155.
, 百拇医药
[5]Cere N, Polack B, Coudert P. Rabbit model of induced Pneumocystis carinii development followed by reinfection [J]. J Eukaryot Microbiol, 1997,44(6):21S.
[6]Settnes OP, Settnes OP, Bille-Hansen V, et al. The piglet as a potential model of Pneumocystis carinii pneumonia [J]. J Protozool, 1991,38(6):140S～141S.
[7]McFadden DC, Powles MA, Smith JG AU, et al. Use of anti-CD4+ hybridoma cells to induce Pneumocystis carinii in mice [J]. Infect Immun, 1994,62(11):4887～4892.
(收稿日期 1999-05-30), http://www.100md.com
单位：颜苹苹(福建省流行病研究所， 福建 福州 350001)；严延生(福建省流行病研究所， 福建 福州 350001)；何似(福建省流行病研究所， 福建 福州 350001)
关键词：卡氏肺孢子虫肺炎；动物模型
疾病控制杂志000126
【摘 要】 目的 为开展人卡氏肺孢子虫的病原学形态观察、免疫化学、分子生物学特性以及药物治疗的研究建立卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型。方法 给SD大鼠腹股沟皮下注射醋酸可的松，6～12周后，收集支气管肺泡灌洗液和制作肺组织印片，组化染色，镜下观察。结果 实验大鼠的肺印片肺孢子虫病原学染色阳性率为96%(24/25)，在24只肺孢子虫病原学染色检查阳性的大鼠中，11只大鼠BALs沉淀涂片阳性。本次诱导实验包囊检出时间最早的为用药40天，且随用药时间的延长，感染程度逐渐加重。对照组均未检出阳性。结论 建立了卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型。
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【分类号】 S865.1； R392 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(2000)01-0067-02
Establishment and detection of pneumocystis carinii pneumonia rat model
YAN Ping-ping YAN Yan-sheng HE Shi
(Fujian Provincial Epidemiology Research Institute, Fuzhou 350001, China)
【Abstract】 Objective To establish pneumocystis carinii penumonia(PCP) rat model and detect human PCP. Methods SD rats were immunosuppressed with biweekly injection of cortisone acetate (25 mg) for 6～12 weeks and then killed. The development of P. carinii lung infection was monitored through giemsa, Weigert-Giemsa and Chalvardjian's toluidine blue-O stainings of lung imprints and brochial aloveolar lavage fluids (BALFs). Results P. Carinii was observed in 24 of 25 experimental SD rats in lung imprints, among which 11 were positive in BALFs. Conclusions SD rat model of PCP has been successfully developed in our experiment. And the induction rate is similar to those reported abroad and higher than results of some domestic reports and has achieved our prospective.
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【Key words】 pneumocystis carinii pneumonia(PCP); rat model
卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocystis Carinii Pneumonia, PCP)已成为AIDS病人和其他免疫缺陷者最常见的、严重的机会性感染。该病临床病情重，缺乏相应体征，且易迅速恶化，未经及时诊治，病死率可高达20%～60%。早期诊断、及时采用针对性的治疗是减低病死率，改善预后的关键。鉴于鼠的卡氏肺孢子虫与人的卡氏肺孢子虫之间病原学形态、核酸和抗原等方面存在的共性，本文通过建立大鼠PCP模型，旨在加深对该病的认识，为开展人卡氏肺孢子虫的病原学形态观察、免疫化学、分子生物学特性以及药物治疗的研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 健康的Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，雌性，体重为150～170 g，上海动物公司提供。低蛋白含量大鼠饲料(8%)，福建省实验动物研究中心配制。醋酸可的松每瓶125 mg，上海第九制药厂生产；四环素片每片25万单位，武汉第四制药厂生产。
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1.2 PCP诱导方式 随机将动物分成实验组、对照组。实验组每笼4只，共7笼，对照组2只。实验组给大鼠腹股沟皮下注射醋酸可的松每只25 mg，每周两次，同时饮水中加入四环素1 g*L-1，以预防细菌性感染。对照组不给药。
1.3 动物解剖及标本采集 6～12周后陆续剖杀大鼠。无菌分离并部分横断切开气管，插入连接有5 ml注射器(内装生理盐水)、粗细适宜的塑料导管，并加以固定。通过注射器行支气管肺泡灌洗(brochial aloveolar lavage fluids. BALs)，连续7～8次，回收30～40 ml的支气管肺泡灌洗液。2 000 rpm离心10 min，弃去上清液，取少量沉淀涂片。生理盐水洗净肺脏表面血液，切开肺脏各叶，制成肺组织印片，BALs沉淀、肺组织冻存在-20℃。
1.4 病原学染色、镜检 姬姆萨染色：肺组织印片和肺内灌洗液涂片先经甲醇固定2 min，然后用pH 6.8～7.2磷酸盐缓冲液(PBS)按1∶20稀释姬姆萨原液制成染液，染色2 h，油镜下观察。瑞-姬姆萨染色：将瑞-姬姆萨染色液(1.0 g瑞氏染料和0.5 g姬姆萨染料深于500 ml甲醇配制而成)直接滴加在印片或涂片上，进行染色5～10 min，油镜下观察[1]。亚甲胺兰染色：将0.1%亚甲胺兰染色滴加在印片或涂片上，进行染色5～20 min，油镜下观察。
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2 结果
2.1 一般状况
2.1.1 对照组 大鼠情况良好，体毛色泽光亮，活动、摄食良好。实验开始时平均体重为(159.06±13.43) g，第6周(226.50±13.43) g，增加约42%，动物均健康存活。
2.1.2 实验组 大鼠用药第2周后，体重不升或开始下降。实验开始时平均体重为(156.89±6.39) g，第6周存活鼠体重为(118.76±10.25) g，体重减少约32%。动物活动及摄食减少，挤在鼠笼的角落、萎糜、逐渐消瘦，出现斑片状脱毛、毛色晦暗无光泽，眼球从透亮的红色变暗、眼圈发紫、呼吸急促，最后多因衰竭、呼吸极度困难而死亡。
2.1.3 感染阳性率 SD大鼠30只，其中2只作为正常对照，不注射药物，28只作为实验组给药。实验大鼠于第27、30、31日各死亡1只，未作病原学检查，以上3只从实验组中剔除。其余27只继续用药第6周，开始陆续剖杀大鼠。25只中24只实验大鼠的肺印片肺孢子虫病原学染色检查均为阳性，阳性率为96%(24/25)。在24只肺孢子虫病原学染色检查阳性的大鼠中，11只大鼠BALs沉淀涂片阳性。本次诱导实验包囊检出时间最早的为用药40天，且随用药时间的延长，感染程度逐渐加重。对照组均未检出阳性。
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2.2 病原学染色特征 姬姆萨染色：包囊囊壁不着色，囊内可见呈紫红色的2～8个囊内小体，排列成团状。瑞-姬姆萨染色：镜下观察的结果与姬姆萨染色基本一致。亚甲胺兰染色：包囊囊壁呈紫蓝色，圆形或椭圆形，囊内小体不着色。
3 讨论
卡氏肺孢子虫感染是呼吸道一种严重的机会感染性疾病，20世纪50年代初，本病仅见于早产儿、营养不良儿，随着器官移植、肿瘤化疗的发展，免疫抑制剂和糖皮质激素的广泛应用，获得性免疫缺陷综合征的出现和流行，PCP的发病率剧增。
我省自1987年发现首例艾滋病以来，目前发现的艾滋病病毒感染者/艾滋病病人超过百例，艾滋病病人三十多例，他们大部分有呼吸道感染的表现，但是由于缺乏有效的检测手段，均未能明确诊断，影响采取及时的对症治疗。根据鼠的卡氏肺孢子虫与人的卡氏肺孢子虫之间在病原学形态、DNA及抗原性存在的共性，本文探讨大鼠PCP模型的建立，为开展人卡氏肺孢子虫的病原学形态观察、免疫化学、生物学特性及分子生物学的研究奠定基础。建立动物模型机理是基于当各种原因造成机体免疫功能低下时，潜伏状态的卡氏肺孢子虫将大量生长繁殖，形成“潜伏状态再激活”，引起病理改变和临床症状。报道中，用于诱导动物模型的动物有大鼠、BALB/C小鼠[2～4]和新西兰白兔[5]、猪[6]等，但以大鼠最为常用。国内多采用Wistar大鼠，而国外多采用SD大鼠。动物的诱导方式主要有两种：使用糖皮质激素或抗CD4单克隆抗体[7]。糖皮质激素的使用可以口服(将糖皮质激素加在动物的饮水中，让其自行饮用)，也可以皮下注射，但以皮下注射诱导的成功率较高。口服药物有醋酸地塞米松(1.5～2.0 ml*L-1)或强的松龙100 ml*L-1，注射常用药物有醋酸可的松每次25 ml或氢化可的松25 ml，每周2次，共进行6～12周。考虑到SD大鼠性情较Wistar大鼠温和，便于饲养、管理和给药，而且也与国外的方法接轨，本次研究采用SD大鼠。为了保证实验的诱导效率，采用了皮下注射醋酸可的松的方法，取得了较满意的结果，感染阳性率为96%，与国外的报道相似，较某些国内报道高。
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在病原学检测方面，采用三种不同的染色方法，姬姆萨染色与瑞-姬姆萨染色和亚甲胺兰染色，其中前两者是染卡氏肺孢子虫的囊内小体，后者是染囊壁，联合使用不同机理染色方法的目的是提高诊断率和检测的准确性。实验中我们注意到姬姆萨染色与瑞-姬姆萨染色的效果相似，但是瑞-姬姆萨染色较姬姆萨染色简便、耗时少，可以考虑作为病原形态学的快速诊断方法。为了进一步提高检测的敏感性和特异性，国外已有采用分子生物学手段检测卡氏肺孢子虫DNA的报道，这也将是我们进一步要开展的工作。
【作者简介】 颜苹苹(1965-)，女，福建晋江人，主管医师，硕士，1997年赴英国留学，获英国伦敦泌尿生殖医学证书(Diploma in GU Medicine)
【参考文献】
[1]瞿介明，何礼贤，李锡莹，等. 卡氏肺孢子虫快速染色法 [J]. 上海医科大学学报，1994，21(4)：275～277.
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[2]Evans R, Joss AW, Pennington TH, et al. Progression of Pneumocystis carinii infection in an animal model [J]. J Med Microbiol, 1998,47(6):543～546.
[3]Boylan CJ, Current WL. Improved rat model of Pneumocystis carinii pneumonia: induced laboratory infections in Pneumocystis-free animals [J]. Infect Immun, 1992,60(4):1589～1597.
[4]McFadden DC, Powles MA, Pittarelli LA AU, et al. Establishment of Pneumocystis carinii in various mouse strains using natural transmission to initiate infection [J]. J Antimicrob Chemother, 1995,36(1):137～155.
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[5]Cere N, Polack B, Coudert P. Rabbit model of induced Pneumocystis carinii development followed by reinfection [J]. J Eukaryot Microbiol, 1997,44(6):21S.
[6]Settnes OP, Settnes OP, Bille-Hansen V, et al. The piglet as a potential model of Pneumocystis carinii pneumonia [J]. J Protozool, 1991,38(6):140S～141S.
[7]McFadden DC, Powles MA, Smith JG AU, et al. Use of anti-CD4+ hybridoma cells to induce Pneumocystis carinii in mice [J]. Infect Immun, 1994,62(11):4887～4892.
(收稿日期 1999-05-30), http://www.100md.com