人胰岛素原基因在体外培养的NIH 3T3细胞中的基因转移和表达的研究
作者：白然 李昌臣 李跃
单位：
关键词：
中华内分泌代谢杂志000103 摘 要：目的 观察瘦素基因5'非翻译区第19位核苷酸(nt+19)A→G变异与中国人2型糖尿病患者脂代谢、体脂含量及分布的关系。方法 351例无亲缘关系中国人(其中糖耐量正常者188例，2型糖尿病163例)用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测瘦素基因nt+19 A→G变异。结果 在2型糖尿病组中，该基因变异与男性的总胆固醇(TC)水平及低密度脂蛋白-胆固醇水平相关(P值分别为0.0036及0.0022)，与女性的腹部皮下脂肪截面积(SA)相关(P=0.0401)。应用协方差分析作体重指数校正后，无论是2型糖尿病男性或女性亚组中，均可见GG纯合子具有较高的SA(P值分别为0.0255及0.0432)。进一步用Logistic回归分析发现：瘦素基因nt+19 A→G变异与2型糖尿病男性的SA(P=0.0005)、腹部内脏脂肪截面积(VA)(P=0.0286)及TC(P=0.0262)相关，在2型糖尿病女性中与SA(P=0.0002)及VA(P=0.0043)相关。结论 瘦素基因nt+19 A→G变异影响中国人2型糖尿病局部体脂分布，且主要影响腹部皮下脂肪的分布。
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The association between nt+19 A→G variant of the leptin gene and lipid metabolism, body fat distribution in type 2 diabetic Chinese
ZHANG Rong ZHENG Yiman XIANG Kunsan et al
(Department of Endocrinology and Metabolism,Diabetes Research Laboratory,Medical Genetics Research Laboratory,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai 200233)
Abstract：Objective To investigate the relationship between nt+19 A→G variant of the leptin (LEP) gene and lipid metabolism, body fat content, body fat distribution in Chinese type 2 DM patients. Methods The genotypes of nt+19 A→G variant in the LEP gene were determined by PCR-RFLP assay in 351 Chinese, including 188 subjects with normal glucose tolerance and 163 type 2 diabetic patients. Results In type 2 diabetic group, an association between nt+19 A→G variant in the LEP gene and serum total cholesterol (TC) level (P=0.0036) and low density lipoprotein-cholesterol level (P=0.0022), was observed in males. While this variant was also associated with abdominal subcutaneous adipose tissue cut area (SA) (P=0.0401) in female. The homozygotes of G-allele in the LEP gene increased SA not only in type 2 diabetic males but also in type 2 diabetic females after correction for body mass index. Furthermore, logistic regression analysis indicated that SA, abdominal visceral adipose tissue cut area (VA) and TC in type 2 diabetic males, as well as SA and VA in type 2 diabetic females were associated with genetic polymorphism of the LEP gene. Conclusion The nt+19 A→G variant in the LEP gene contributes to the regional body fat distribution in type 2 diabetic Chinese, especially the adbominal subcutaneous adipose depots.
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Key words：Mutation; Diabetes mellitus, non-insulin dependent; Leptin; Body fat distribution▲
肥胖症即体脂含量增多及分布异常，由于其与胰岛素抵抗的密切关系而备受全球学者的关注。胰岛素抵抗是2型糖尿病、高血压、冠心病及血脂紊乱等成人常见代谢病的共同发病基础。现已明确，肥胖亦是一种复杂性状(complex traits)，其发生是由多种遗传因素以及环境因素共同作用所致。其中遗传因素对其影响在不同种族中有30%～75%不等〔1〕。自1994年瘦素(leptin)基因被成功定位克隆以来〔2〕，人类在肥胖发生机制的研究领域，尤其是在体脂及能量代谢的分子调控机制方面的研究取得了突破性进展。
瘦素是一种由脂肪细胞合成分泌的“脂肪调节激素”(fat regulating hormone)，它将机体体脂含量的信息传递给体脂恒定调节网络的中枢-下丘脑，从而对摄食行为以及体脂恒定调控产生影响〔3〕。人类瘦素基因位于染色体7q 31.3。近年研究发现该基因区域与人类极度肥胖〔体重指数(BMI)>35kg/m2〕相关联〔4，5〕。本文就瘦素基因外显子1非翻译区第19位核苷酸(nt+19)A→G变异进行研究，以了解该基因变异与中国人2型糖尿病患者脂代谢、体脂含量及分布的关系。
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对象与方法
一、对象
选取无亲缘关系的上海地区中国汉族人351例，按美国糖尿病学会(ADA)1997年糖尿病诊断及分类标准分为糖耐量正常组(NGT组)：188例(男80，女108)，年龄(52.8±11.8)岁，BMI(25.56±4.35)kg/m2；2型糖尿病组(2型DM组)：163例(男74，女89)，年龄(56.3±9.8)岁，BMI(26.71±3.68)kg/m2。
二、方法
1.体脂含量及分布：BMI测定：在脱鞋及穿内衣的相同条件下测身高与体重，BMI为体重(kg)/身高2(m2)。腹部内脏脂肪截面积(VA)、腹部皮下脂肪截面积(SA)以及股部皮下脂肪截面积(FA)测定：运用日本岛津SMT-100型核磁共振仪，研究对象取水平仰卧位，腹部扫描平面为平脐水平(L4-L5)，股部扫描平面为髂嵴至膝关节中点处，以机配软件进行面积计算。
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2.血糖及胰岛素、C肽测定：所有研究对象进行口服75克葡萄糖耐量试验于0、30、60、120及180分钟分别测定血浆葡萄糖(氧化酶法)，血胰岛素(放免法，华西糖尿病科技开发研究所)及C肽(放免法，天津DP公司)。按稳态模式评估法计算β细胞功能(HOMAB)和胰岛素抵抗(HOMAIR)。
3.血脂及瘦素测定：包括空腹脂代谢谱，即总胆固醇(TC，酶法)，甘油三酯(TG，酶法)，高密度及低密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C及LDL-C，硫酸葡聚糖-锰沉淀法及公式计算)。空腹血清瘦素(放免法，Linco Co.)。
4.血压：常规袖套式血压计测定收缩压(SP)及舒张压(DP)。
5.瘦素基因nt+19 A→G变异检测：常规酚/氯仿法抽提外周血基因组DNA。以0.1μg DNA为模板在总反应体积30μl内行聚合酶链反应(PCR)扩增〔6〕：上游引物为5'-CCCCGCGAGGTGCACACTG-3'，下游引物为5'-AAGGAGGAAGGAGCGCGCC-3'(赛百胜公司合成)。反应条件：95℃变性5分钟后进行30个循环，每个周期变性95℃1分钟，退火及延伸72℃2分钟，终末延伸72℃10分钟。扩增产物223bp，经2%琼脂糖电泳确认扩增结果后，以限制性内切酶MspA1I(Biolab)37℃酶解PCR产物过夜。用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶解产物片段，溴化乙锭染色后紫外光下观察结果：AA纯合子无MspA1I酶切位点，仅见223bp带，GG纯合子为184bp带，GA杂合子见223bp及184bp带。
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6.统计学处理：运用Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。用基因计数法计算各组基因型频率及等位基因频率。各组间频率比较运用Fisher双侧确切检验。由于AA基因型及GA基因型其临床变量数值接近，故将两组合并简称为A组进行统计学分析，而GG基因型者则简称为G组。各组间临床变量比较运用方差(ANOVA)检验。正态分布临床变量以
±s表示；非正态分布临床变量则经以10为底对数转换后进行比较，数据用未经对数转换的中位数(25%位数，75%位数)表示。相关的临床变量应用协方差(ANCOVA)分析校正一些影响因素后进一步比较，以校正x±sx表示。以Logistic回归分析瘦素基因型的独立相关变量。以上分析用SAS软件进行。
结果
一、中国人瘦素基因nt+19 A→G变异与肥胖的关系
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分别以BMI 25kg/m2及30kg/m2为分割点，进行基因型频率及等位基因频率的组间比较，结果均无显著差异(表1)。
表1 瘦素基因nt+19 A→G变异与中国人肥胖的关系
Tab 1 Relationship between frequency of nt+19 A→G
variant of the leptin gene and obesity in Chinese 基因
Gene
以BMI 25为分割点
Cutoff with BMI 25
以BMI 25，30为分割点
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Cutoff with BMI 25 and 30
基因型
Genotype
GG
112
89
34
78
89
GA
86
49
26
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60
49
AA
6
9
2
4
9
等位基因
Allele
G
310
227
94
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216
227
A
98
67
30
68
67
注：BMI：体重指数 Body mass index
二、瘦素基因nt+19 A→G变异与糖脂代谢、体脂含量及分布的关系
2型糖尿病组中，按性别分组，可见瘦素基因nt+19 A→G变异与中国人2型糖尿病男性TC水平(P=0.0036)及LDL-C水平(P=0.0022)相关，GG纯合子具有较高的TC及LDL-C水平。在2型糖尿病女性亚组中，该变异与SA相关(P=0.0401)且GG 纯合子 SA 较高 (表2)。应 用协方差分析 作BMI校正后，无论是在2型DM男性或2型DM女性亚组中，均发现瘦素基因nt+19 A→G变异与SA相关(P值分别为0.0255及0.0432)，GG纯合子SA水平均高于A携带者(表3)。NGT组中未见该基因变异与上述各临床变量相关(具体数据未列出)。
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表2 中国人2型糖尿病瘦素基因nt+19 A→G变异与临床变量的关系(±s)
Tab 2 Relationship between nt+19 A→G variant of the leptin gene and clinical
variables in Chinese type 2 diabetic patients (±s) 组别
Group
例数
Number
正态变量
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Normal variable
Age
(year)
BMI
(kg/m2)
SP
(mmHg)
DP
(mmHg)
FPG
(mmol/L)
2h-PG
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(mmol/L)
SA
(cm2)
FA
(cm2)
VA
(cm2)
TC
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
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(mmol/L)
2型DM男性亚组
Type 2 diabetic males
G组
G group
34
57.97±9.98
25.78±2.63
132.06±31.48
84.09±18.27
7.72±2.66
14.30±5.19
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149.36±36.80
50.57±16.04
108.53±43.10
6.05±1.56
1.11±0.34
4.25±1.65
A组
A group
40
56.55±9.62
26.70±3.35
137.13±29.33
, 百拇医药
86.93±18.04
7.18±2.14
12.96±4.29
143.48±44.89
54.97±20.14
105.59±34.81
5.03±1.34**
1.14±0.38
3.15±1.35**
2型DM女性亚组
Type 2 diabetic females
, 百拇医药
G组
G group
49
55.20±9.23
27.49±4.18
130.98±39.56
81.24±24.04
6.82±1.88
12.48±4.52
246.48±80.61
97.93±29.38
98.37±47.36
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5.74±1.43
1.19±0.40
3.87±1.48
A组
A group
40
56.15±10.45
26.56±4.02
133.33±28.47
81.18±16.56
7.14±1.74
12.99±4.79
, 百拇医药
213.50±65.68*
95.54±28.50
104.86±49.13
5.64±1.30
1.22±0.33
3.72±1.27
组别
Group
例数
Number
of cases
偏态变量
, 百拇医药
Bias variable
0'-CP
2h-CP
0'-INS
2h-INS
Leptin
TG
HOMAIR
HOMAB
2型DM男性亚组
Type 2 diabetic males
G组
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G group
34
2.32
(1.85,2.95)
6.62
(4.24,8.0)
9.52
(8.41,14.46)
24.66
(15.07,46.93)
4.12
(2.9,7.83)〔22
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1.54
(1.09,2.36)
3.35
(2.56,4.71)
68.64
(26.88,125.74)
A组
A group
40
2.07
(1.59,3.0)
6.16
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(4.09,8.26)
10.44
(7.98,16.02)
31.49
(17.61,39.68)
3.58
(2.41,5.79)〔23
1.36
(1.11,2.19)
3.17
(2.06,5.26)
75.01
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(38.91,118.61)
2型DM女性亚组
Type 2 diabetic females
G组
G group
49
2.55
(1.93,3.17)
8.51
(6.12,11.61)
13.49
(6.87,20.46)
, 百拇医药
44.99
(21.36,89.82)
10.25
(6.9,16.18)〔24〕
1.53
(1.02,2.08)
3.6
(1.77,6.95)
99.27
(57.7,163.37)
A组
A group
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40
2.40
(1.80,3.22)
8.43
(6.88,10.11)
12.78
(8.65,17.99)
33.66
(22.12,54.62)
15.50
(9.73,19.24)〔24〕
1.65
, 百拇医药
(1.16,2.32)
3.6
(2.88，5.98)
75.72
(48.83,118.74)
注：正态变量以(±s)表示 Normal variables were showed as (±s)；偏态变量以中位数(25%位数，75%位数)表示 Bias variables were showed as median (25% position and 75% position)；〔〕内数据为血瘦素的实测例数 Number in 〔〕is the number of cases for assay of leptin；DM：糖尿病 Diabetic mellitus；Age：年龄；BMI：体重指数 Body mass index；SP：收缩压 Systolic pressure；DP：舒张压 Diastolic pressure；FPG：空腹血浆葡萄糖 Fast plasma glucose；2h-PG：餐后2小时血浆葡萄糖 Plasma glucose of postprandial 2 hours；SA：腹部皮下脂肪截面积 Abdominal subcutaneous adipose tissue cut area；FA：股部皮下脂肪截面积 Femoral subcutaneous adipose tissue cut area；VA：腹部内脏脂肪截面积 Abdominal visceral adipose tissue cut area；TC：血清总胆固醇 Total serum cholesterol；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇 High density lipoprotein-cholesterol；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇 Low density lipoprotein-cholesterol；CP：C肽 C-peptide；INS：胰岛素 Insulin；Leptin：瘦素；TG：甘油三酯 Triglyceride；HOMAIR：稳态模式评估法计算胰岛素抵抗；HOMAB：稳态模式评估法计算β细胞功能表3 经协方差校正BMI后中国人2型糖尿病LEP基因nt+19 A→G变异与临床变量的关系
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Tab 3 Relationship between nt+19 A→G variant of the LEP gene and clinical
variable in type 2 diabetic Chinese after correction for BMI by analysis of covariance 组别
Group
例数
Number of
SA(cm2)
VA(cm2)
FA(cm2)
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lg leptin
2型DM男性亚组
Type 2 diabetic males
G组
G group
34
154.37±4.85
112.85±4.96
52.20±2.69
0.65±0.06〔22〕
A组
A group
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40
139.22±4.47*
101.92±4.56
53.59±2.48
0.54±0.05〔23〕
2型DM女性亚组
Type 2 diabetic females
G组
G group
49
240.33±6.29
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95.58±5.71
96.13±3.32
1.01±0.05〔24〕
A组
A group
40
221.03±6.96*
108.28±6.33
97.74±3.68
1.11±0.05〔24〕
注：〔〕内数据为血瘦素的实测例数 Number in 〔〕 is the number of cases for assay of leptin； 缩写词同表2 Abbreviations are same to Tab 2
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三、2型DM组瘦素基因nt+19 A→G变异的独立相关变量
按性别分组，以瘦素基因nt+19 A→G变异的基因型为因变量，以研究对象的各临床变量的自变量进行Logistic回归 分析发现 ：在2型DM男性中SA(P=0.0005)，VA(P=0.0286) 及 TC(P=0.0262)与该基因变异相关，2型DM女性中SA(P=0.0002)及VA(P=0.0043)与之相关。
讨论
近年研究表明，肥胖者脂肪细 胞瘦素基因mRNA水平增高，血清瘦素水平亦明显增高，且瘦素基因表达总量及血清瘦素水平与BMI和体脂含量呈正相关。瘦素基因在脂肪组织内广泛表达，且在不同部位脂肪组织中的表达量各不相同。Harmelen等〔7〕于1998年研究发现在皮下脂肪中瘦素基因mRNA水平是其内脏脂肪中水平的2倍，因此推测瘦素主要是由皮下脂肪组织分泌的。同年Hager〔6〕等发现了瘦素基因外显子1非翻译区nt+19 A→G变异，并且报道该基因变异与白种人肥胖者的血清瘦素水平相关。
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本研究表明：(1)瘦素基因nt+19 A→G变异与中国人血清瘦素水平无明显相关。亦未见该基因变异与糖兴奋前后胰岛素分泌及胰岛素作用、血糖以及血压的相关性。(2)应用协方差分析校正BMI后发现在中国人2型糖尿病组(无论是男性亚组还是女性亚组)，瘦素基因nt+19 A→G变异与SA相关，表现为GG基因型具有较高的SA。而在糖耐量正常组中并未发现此种相关。(3)Logistic回归分析再一次证实在中国人2型DM中与瘦素基因nt+19 A→G变异的独立相关变量为腹部脂肪(SA及VA)。
本研究结果提示在糖尿病与非糖尿病中影响局部体脂含量的遗传因素可能存在差异，同时认为瘦素基因nt+19 A→G变异与2型糖尿病病人局部体脂分布相关，且其主要影响腹部皮下脂肪的分布。这亦与该基因主要在皮下脂肪中表达相吻合。■
基金项目：上海市医学领先专业重点学科基金资助项目(96-Ⅲ-004)、国家自然科学基金资助项目(39800069)；上海市青年科技启明星计划基金资助项目(97QB14021)
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参考文献：
[1]Bouchard C. Current understanding of the etiology of obesity: genetic and non-genetic factors. Am J Clin Nutr, 1991,52:15615-15655.
[2]Zhang Y, Proenca R, Maffei M, et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature, 1994,372:425-432.
[3]Tritos NA, Mantzoros CS. Leptin:its role in obesity and beyond. Diabetologia, 1997,40:1371-1379.
, 百拇医药
[4]Clement K, Garner C, Hager J, et al. Indication for linkage of the human OB gene region with extreme obesity. Diabetes, 1996,45:687-690.
[5]Reed DR, Ding Y, Xu W, et al. Extreme obesity may be linked to markers flanking the human OB gene. Diabetes, 1996,45:691-694.
[6]Hager J, Clement K, Francke S, et al. A polymorphism in the 5' untranslated region of the human ob gene is associated with low leptin levels. Int J Obes, 1998,22:200-205.
[7]Van Harmelen V, Reynisdottir S, Eriksson P, et al. Leptin secretion from subcutaneous and visceral adipose tissue in women. Diabetes, 1998,47:913-917.
收稿日期：1999-07-27, 百拇医药
单位：
关键词：
中华内分泌代谢杂志000103 摘 要：目的 观察瘦素基因5'非翻译区第19位核苷酸(nt+19)A→G变异与中国人2型糖尿病患者脂代谢、体脂含量及分布的关系。方法 351例无亲缘关系中国人(其中糖耐量正常者188例，2型糖尿病163例)用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测瘦素基因nt+19 A→G变异。结果 在2型糖尿病组中，该基因变异与男性的总胆固醇(TC)水平及低密度脂蛋白-胆固醇水平相关(P值分别为0.0036及0.0022)，与女性的腹部皮下脂肪截面积(SA)相关(P=0.0401)。应用协方差分析作体重指数校正后，无论是2型糖尿病男性或女性亚组中，均可见GG纯合子具有较高的SA(P值分别为0.0255及0.0432)。进一步用Logistic回归分析发现：瘦素基因nt+19 A→G变异与2型糖尿病男性的SA(P=0.0005)、腹部内脏脂肪截面积(VA)(P=0.0286)及TC(P=0.0262)相关，在2型糖尿病女性中与SA(P=0.0002)及VA(P=0.0043)相关。结论 瘦素基因nt+19 A→G变异影响中国人2型糖尿病局部体脂分布，且主要影响腹部皮下脂肪的分布。
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The association between nt+19 A→G variant of the leptin gene and lipid metabolism, body fat distribution in type 2 diabetic Chinese
ZHANG Rong ZHENG Yiman XIANG Kunsan et al
(Department of Endocrinology and Metabolism,Diabetes Research Laboratory,Medical Genetics Research Laboratory,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai 200233)
Abstract：Objective To investigate the relationship between nt+19 A→G variant of the leptin (LEP) gene and lipid metabolism, body fat content, body fat distribution in Chinese type 2 DM patients. Methods The genotypes of nt+19 A→G variant in the LEP gene were determined by PCR-RFLP assay in 351 Chinese, including 188 subjects with normal glucose tolerance and 163 type 2 diabetic patients. Results In type 2 diabetic group, an association between nt+19 A→G variant in the LEP gene and serum total cholesterol (TC) level (P=0.0036) and low density lipoprotein-cholesterol level (P=0.0022), was observed in males. While this variant was also associated with abdominal subcutaneous adipose tissue cut area (SA) (P=0.0401) in female. The homozygotes of G-allele in the LEP gene increased SA not only in type 2 diabetic males but also in type 2 diabetic females after correction for body mass index. Furthermore, logistic regression analysis indicated that SA, abdominal visceral adipose tissue cut area (VA) and TC in type 2 diabetic males, as well as SA and VA in type 2 diabetic females were associated with genetic polymorphism of the LEP gene. Conclusion The nt+19 A→G variant in the LEP gene contributes to the regional body fat distribution in type 2 diabetic Chinese, especially the adbominal subcutaneous adipose depots.
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Key words：Mutation; Diabetes mellitus, non-insulin dependent; Leptin; Body fat distribution▲
肥胖症即体脂含量增多及分布异常，由于其与胰岛素抵抗的密切关系而备受全球学者的关注。胰岛素抵抗是2型糖尿病、高血压、冠心病及血脂紊乱等成人常见代谢病的共同发病基础。现已明确，肥胖亦是一种复杂性状(complex traits)，其发生是由多种遗传因素以及环境因素共同作用所致。其中遗传因素对其影响在不同种族中有30%～75%不等〔1〕。自1994年瘦素(leptin)基因被成功定位克隆以来〔2〕，人类在肥胖发生机制的研究领域，尤其是在体脂及能量代谢的分子调控机制方面的研究取得了突破性进展。
瘦素是一种由脂肪细胞合成分泌的“脂肪调节激素”(fat regulating hormone)，它将机体体脂含量的信息传递给体脂恒定调节网络的中枢-下丘脑，从而对摄食行为以及体脂恒定调控产生影响〔3〕。人类瘦素基因位于染色体7q 31.3。近年研究发现该基因区域与人类极度肥胖〔体重指数(BMI)>35kg/m2〕相关联〔4，5〕。本文就瘦素基因外显子1非翻译区第19位核苷酸(nt+19)A→G变异进行研究，以了解该基因变异与中国人2型糖尿病患者脂代谢、体脂含量及分布的关系。
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对象与方法
一、对象
选取无亲缘关系的上海地区中国汉族人351例，按美国糖尿病学会(ADA)1997年糖尿病诊断及分类标准分为糖耐量正常组(NGT组)：188例(男80，女108)，年龄(52.8±11.8)岁，BMI(25.56±4.35)kg/m2；2型糖尿病组(2型DM组)：163例(男74，女89)，年龄(56.3±9.8)岁，BMI(26.71±3.68)kg/m2。
二、方法
1.体脂含量及分布：BMI测定：在脱鞋及穿内衣的相同条件下测身高与体重，BMI为体重(kg)/身高2(m2)。腹部内脏脂肪截面积(VA)、腹部皮下脂肪截面积(SA)以及股部皮下脂肪截面积(FA)测定：运用日本岛津SMT-100型核磁共振仪，研究对象取水平仰卧位，腹部扫描平面为平脐水平(L4-L5)，股部扫描平面为髂嵴至膝关节中点处，以机配软件进行面积计算。
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2.血糖及胰岛素、C肽测定：所有研究对象进行口服75克葡萄糖耐量试验于0、30、60、120及180分钟分别测定血浆葡萄糖(氧化酶法)，血胰岛素(放免法，华西糖尿病科技开发研究所)及C肽(放免法，天津DP公司)。按稳态模式评估法计算β细胞功能(HOMAB)和胰岛素抵抗(HOMAIR)。
3.血脂及瘦素测定：包括空腹脂代谢谱，即总胆固醇(TC，酶法)，甘油三酯(TG，酶法)，高密度及低密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C及LDL-C，硫酸葡聚糖-锰沉淀法及公式计算)。空腹血清瘦素(放免法，Linco Co.)。
4.血压：常规袖套式血压计测定收缩压(SP)及舒张压(DP)。
5.瘦素基因nt+19 A→G变异检测：常规酚/氯仿法抽提外周血基因组DNA。以0.1μg DNA为模板在总反应体积30μl内行聚合酶链反应(PCR)扩增〔6〕：上游引物为5'-CCCCGCGAGGTGCACACTG-3'，下游引物为5'-AAGGAGGAAGGAGCGCGCC-3'(赛百胜公司合成)。反应条件：95℃变性5分钟后进行30个循环，每个周期变性95℃1分钟，退火及延伸72℃2分钟，终末延伸72℃10分钟。扩增产物223bp，经2%琼脂糖电泳确认扩增结果后，以限制性内切酶MspA1I(Biolab)37℃酶解PCR产物过夜。用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶解产物片段，溴化乙锭染色后紫外光下观察结果：AA纯合子无MspA1I酶切位点，仅见223bp带，GG纯合子为184bp带，GA杂合子见223bp及184bp带。
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6.统计学处理：运用Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。用基因计数法计算各组基因型频率及等位基因频率。各组间频率比较运用Fisher双侧确切检验。由于AA基因型及GA基因型其临床变量数值接近，故将两组合并简称为A组进行统计学分析，而GG基因型者则简称为G组。各组间临床变量比较运用方差(ANOVA)检验。正态分布临床变量以
±s表示；非正态分布临床变量则经以10为底对数转换后进行比较，数据用未经对数转换的中位数(25%位数，75%位数)表示。相关的临床变量应用协方差(ANCOVA)分析校正一些影响因素后进一步比较，以校正x±sx表示。以Logistic回归分析瘦素基因型的独立相关变量。以上分析用SAS软件进行。结果
一、中国人瘦素基因nt+19 A→G变异与肥胖的关系
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分别以BMI 25kg/m2及30kg/m2为分割点，进行基因型频率及等位基因频率的组间比较，结果均无显著差异(表1)。
表1 瘦素基因nt+19 A→G变异与中国人肥胖的关系
Tab 1 Relationship between frequency of nt+19 A→G
variant of the leptin gene and obesity in Chinese 基因
Gene
以BMI 25为分割点
Cutoff with BMI 25
以BMI 25，30为分割点
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Cutoff with BMI 25 and 30
基因型
Genotype
GG
112
89
34
78
89
GA
86
49
26
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60
49
AA
6
9
2
4
9
等位基因
Allele
G
310
227
94
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216
227
A
98
67
30
68
67
注：BMI：体重指数 Body mass index
二、瘦素基因nt+19 A→G变异与糖脂代谢、体脂含量及分布的关系
2型糖尿病组中，按性别分组，可见瘦素基因nt+19 A→G变异与中国人2型糖尿病男性TC水平(P=0.0036)及LDL-C水平(P=0.0022)相关，GG纯合子具有较高的TC及LDL-C水平。在2型糖尿病女性亚组中，该变异与SA相关(P=0.0401)且GG 纯合子 SA 较高 (表2)。应 用协方差分析 作BMI校正后，无论是在2型DM男性或2型DM女性亚组中，均发现瘦素基因nt+19 A→G变异与SA相关(P值分别为0.0255及0.0432)，GG纯合子SA水平均高于A携带者(表3)。NGT组中未见该基因变异与上述各临床变量相关(具体数据未列出)。
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表2 中国人2型糖尿病瘦素基因nt+19 A→G变异与临床变量的关系(
±s)Tab 2 Relationship between nt+19 A→G variant of the leptin gene and clinical
variables in Chinese type 2 diabetic patients (
±s) 组别Group
例数
Number
正态变量
, 百拇医药
Normal variable
Age
(year)
BMI
(kg/m2)
SP
(mmHg)
DP
(mmHg)
FPG
(mmol/L)
2h-PG
, 百拇医药
(mmol/L)
SA
(cm2)
FA
(cm2)
VA
(cm2)
TC
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
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(mmol/L)
2型DM男性亚组
Type 2 diabetic males
G组
G group
34
57.97±9.98
25.78±2.63
132.06±31.48
84.09±18.27
7.72±2.66
14.30±5.19
, 百拇医药
149.36±36.80
50.57±16.04
108.53±43.10
6.05±1.56
1.11±0.34
4.25±1.65
A组
A group
40
56.55±9.62
26.70±3.35
137.13±29.33
, 百拇医药
86.93±18.04
7.18±2.14
12.96±4.29
143.48±44.89
54.97±20.14
105.59±34.81
5.03±1.34**
1.14±0.38
3.15±1.35**
2型DM女性亚组
Type 2 diabetic females
, 百拇医药
G组
G group
49
55.20±9.23
27.49±4.18
130.98±39.56
81.24±24.04
6.82±1.88
12.48±4.52
246.48±80.61
97.93±29.38
98.37±47.36
, http://www.100md.com
5.74±1.43
1.19±0.40
3.87±1.48
A组
A group
40
56.15±10.45
26.56±4.02
133.33±28.47
81.18±16.56
7.14±1.74
12.99±4.79
, 百拇医药
213.50±65.68*
95.54±28.50
104.86±49.13
5.64±1.30
1.22±0.33
3.72±1.27
组别
Group
例数
Number
of cases
偏态变量
, 百拇医药
Bias variable
0'-CP
2h-CP
0'-INS
2h-INS
Leptin
TG
HOMAIR
HOMAB
2型DM男性亚组
Type 2 diabetic males
G组
, http://www.100md.com
G group
34
2.32
(1.85,2.95)
6.62
(4.24,8.0)
9.52
(8.41,14.46)
24.66
(15.07,46.93)
4.12
(2.9,7.83)〔22
, 百拇医药
1.54
(1.09,2.36)
3.35
(2.56,4.71)
68.64
(26.88,125.74)
A组
A group
40
2.07
(1.59,3.0)
6.16
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(4.09,8.26)
10.44
(7.98,16.02)
31.49
(17.61,39.68)
3.58
(2.41,5.79)〔23
1.36
(1.11,2.19)
3.17
(2.06,5.26)
75.01
, http://www.100md.com
(38.91,118.61)
2型DM女性亚组
Type 2 diabetic females
G组
G group
49
2.55
(1.93,3.17)
8.51
(6.12,11.61)
13.49
(6.87,20.46)
, 百拇医药
44.99
(21.36,89.82)
10.25
(6.9,16.18)〔24〕
1.53
(1.02,2.08)
3.6
(1.77,6.95)
99.27
(57.7,163.37)
A组
A group
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40
2.40
(1.80,3.22)
8.43
(6.88,10.11)
12.78
(8.65,17.99)
33.66
(22.12,54.62)
15.50
(9.73,19.24)〔24〕
1.65
, 百拇医药
(1.16,2.32)
3.6
(2.88，5.98)
75.72
(48.83,118.74)
注：正态变量以(
±s)表示 Normal variables were showed as (±s)；偏态变量以中位数(25%位数，75%位数)表示 Bias variables were showed as median (25% position and 75% position)；〔〕内数据为血瘦素的实测例数 Number in 〔〕is the number of cases for assay of leptin；DM：糖尿病 Diabetic mellitus；Age：年龄；BMI：体重指数 Body mass index；SP：收缩压 Systolic pressure；DP：舒张压 Diastolic pressure；FPG：空腹血浆葡萄糖 Fast plasma glucose；2h-PG：餐后2小时血浆葡萄糖 Plasma glucose of postprandial 2 hours；SA：腹部皮下脂肪截面积 Abdominal subcutaneous adipose tissue cut area；FA：股部皮下脂肪截面积 Femoral subcutaneous adipose tissue cut area；VA：腹部内脏脂肪截面积 Abdominal visceral adipose tissue cut area；TC：血清总胆固醇 Total serum cholesterol；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇 High density lipoprotein-cholesterol；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇 Low density lipoprotein-cholesterol；CP：C肽 C-peptide；INS：胰岛素 Insulin；Leptin：瘦素；TG：甘油三酯 Triglyceride；HOMAIR：稳态模式评估法计算胰岛素抵抗；HOMAB：稳态模式评估法计算β细胞功能表3 经协方差校正BMI后中国人2型糖尿病LEP基因nt+19 A→G变异与临床变量的关系, 百拇医药
Tab 3 Relationship between nt+19 A→G variant of the LEP gene and clinical
variable in type 2 diabetic Chinese after correction for BMI by analysis of covariance 组别
Group
例数
Number of
SA(cm2)
VA(cm2)
FA(cm2)
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lg leptin
2型DM男性亚组
Type 2 diabetic males
G组
G group
34
154.37±4.85
112.85±4.96
52.20±2.69
0.65±0.06〔22〕
A组
A group
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40
139.22±4.47*
101.92±4.56
53.59±2.48
0.54±0.05〔23〕
2型DM女性亚组
Type 2 diabetic females
G组
G group
49
240.33±6.29
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95.58±5.71
96.13±3.32
1.01±0.05〔24〕
A组
A group
40
221.03±6.96*
108.28±6.33
97.74±3.68
1.11±0.05〔24〕
注：〔〕内数据为血瘦素的实测例数 Number in 〔〕 is the number of cases for assay of leptin； 缩写词同表2 Abbreviations are same to Tab 2
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三、2型DM组瘦素基因nt+19 A→G变异的独立相关变量
按性别分组，以瘦素基因nt+19 A→G变异的基因型为因变量，以研究对象的各临床变量的自变量进行Logistic回归 分析发现 ：在2型DM男性中SA(P=0.0005)，VA(P=0.0286) 及 TC(P=0.0262)与该基因变异相关，2型DM女性中SA(P=0.0002)及VA(P=0.0043)与之相关。
讨论
近年研究表明，肥胖者脂肪细 胞瘦素基因mRNA水平增高，血清瘦素水平亦明显增高，且瘦素基因表达总量及血清瘦素水平与BMI和体脂含量呈正相关。瘦素基因在脂肪组织内广泛表达，且在不同部位脂肪组织中的表达量各不相同。Harmelen等〔7〕于1998年研究发现在皮下脂肪中瘦素基因mRNA水平是其内脏脂肪中水平的2倍，因此推测瘦素主要是由皮下脂肪组织分泌的。同年Hager〔6〕等发现了瘦素基因外显子1非翻译区nt+19 A→G变异，并且报道该基因变异与白种人肥胖者的血清瘦素水平相关。
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本研究表明：(1)瘦素基因nt+19 A→G变异与中国人血清瘦素水平无明显相关。亦未见该基因变异与糖兴奋前后胰岛素分泌及胰岛素作用、血糖以及血压的相关性。(2)应用协方差分析校正BMI后发现在中国人2型糖尿病组(无论是男性亚组还是女性亚组)，瘦素基因nt+19 A→G变异与SA相关，表现为GG基因型具有较高的SA。而在糖耐量正常组中并未发现此种相关。(3)Logistic回归分析再一次证实在中国人2型DM中与瘦素基因nt+19 A→G变异的独立相关变量为腹部脂肪(SA及VA)。
本研究结果提示在糖尿病与非糖尿病中影响局部体脂含量的遗传因素可能存在差异，同时认为瘦素基因nt+19 A→G变异与2型糖尿病病人局部体脂分布相关，且其主要影响腹部皮下脂肪的分布。这亦与该基因主要在皮下脂肪中表达相吻合。■
基金项目：上海市医学领先专业重点学科基金资助项目(96-Ⅲ-004)、国家自然科学基金资助项目(39800069)；上海市青年科技启明星计划基金资助项目(97QB14021)
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参考文献：
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[2]Zhang Y, Proenca R, Maffei M, et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature, 1994,372:425-432.
[3]Tritos NA, Mantzoros CS. Leptin:its role in obesity and beyond. Diabetologia, 1997,40:1371-1379.
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[4]Clement K, Garner C, Hager J, et al. Indication for linkage of the human OB gene region with extreme obesity. Diabetes, 1996,45:687-690.
[5]Reed DR, Ding Y, Xu W, et al. Extreme obesity may be linked to markers flanking the human OB gene. Diabetes, 1996,45:691-694.
[6]Hager J, Clement K, Francke S, et al. A polymorphism in the 5' untranslated region of the human ob gene is associated with low leptin levels. Int J Obes, 1998,22:200-205.
[7]Van Harmelen V, Reynisdottir S, Eriksson P, et al. Leptin secretion from subcutaneous and visceral adipose tissue in women. Diabetes, 1998,47:913-917.
收稿日期：1999-07-27, 百拇医药