随机扩增多态性DNA鉴定酵母菌的初步探讨
作者：杨继勇 周贵民 谢灵
单位：解放军总医院微生物科，北京 100853
关键词：随机扩增多态性DNA；酵母菌；多聚酶链反应
军医进修学院学报000125摘 要：目的：应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对临床上常见的酵母菌进行分析，以选择合适的引物和实验条件对酵母菌进行鉴定。方法：选用四条长度为10个碱基的随机引物分别对酵母菌、丝状真菌及细菌进行扩增，并对扩增结果进行相似性分析。结果：所选三条引物可在种的水平上将所试菌株有效地区分开来，但同一引物对不同菌种的扩增结果存在明显的差异。在扩增同种内不同菌株时，各菌株间也存在着一定的差异。采用不同引物进行扩增时种内变异的程度有所不同。除个别菌株外，扩增所得指纹图型的种类差异远远小于不同的菌种间的差异，因而可将不同种的酵母菌有效地区分开来。结论：RAPD技术可用于酵母菌的种间鉴定。其中引物及实验条件的选择尤为重要，同时，将多条引物扩增结果共同用于结果分析将有助于提高鉴定的可靠性。
, 百拇医药
中图号：R379 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0073-76
The preliminary study for the identification of yeasts by RAPD
YANG Ji-yong, ZHOU Gui-min, XIE Ling
(Department of Microbiology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective：To analysis DNA polymorphism in different species and strains of the medically important yeasts by random amplified polymorphic DNA (RAPD).Methods：By using four short oligonucleotide primers (10-mers) with arbitrarily chosen sequences in the polymerase chain reaction,we detected 13 different yeasts、2 other fungal species and 2 bacteria. Similarity analysis was also employed.Results：The number and size of the amplification products were characteristic for each species. Interspecies variation was observed within the genus yeasts, and species colud be clearly distinguished by their RAPD profiles. The RAPD profile derived from different primers had distinct diversity. By using same primer, intraspecies DNA length polymorphisms were seen for RAPD profiles and similarity analysis from different species.Especially,the intraspecies polymorphism from Crytococcus neoformans was very obvious. By using different primers,the intraspecies variation of RAPD profiles was different. Except few strains,using primer Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ, the variation among profiles obtained from different strains of the same species was far less than the variation observed among different species of yeasts. So different yeast species could be distinguished by their RAPD profiles.Conclusion：RAPD can be used in the interspecies detection of Yeasts.It is very important to choose primers and experimental conditions. The reliability of detection would be improved by using combinations of oligonucleotide primers.
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Key words：random amplified polymophic DNA; yeasts; polymerase chain reaction▲
近年来，由酵母菌引起的感染有上升的趋势。在感染菌种的分布上，以往以白念珠菌为主，近来非白念珠菌所致感染显著增加。因此，对实验室快速、准确地做出病原学诊断提出了更高的要求[1～3]。随机扩增多态性DNA(RAPD)技术首先由Williams[4]和Welsh[5]等介绍。我们选用4条长度为10个碱基的随机引物对 13 种酵母菌、 2 种丝状真菌和 2 种细菌进行了扩增，得到具有种特异性的RAPD型。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 引物 引物Ⅰ、Ⅱ参照有关文献确定序列，引物Ⅲ、Ⅳ由美国Operon公司随机引物试剂盒A组 20 条引物中选出。 4 条引物均由中国科学院微生物所BECKMAN OLIGO 1000M DNA合成仪合成。
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表1 所用引物来源及序列 编号
来 源
序 列
Ⅰ
Ap3[4]
5′-TCGTAGCCAA-3′
Ⅱ
RP2[6]
5′-AAGGATCAGA-3′
Ⅲ
OPA-4
5′-AATCGGGCTG-3′
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Ⅳ
OPA-10
5′-GTGATCGCAG-3′
1.1.2 实验菌株 见表2。表2 实验菌株 编号
代号
菌 种
1～5
A1～A5
白念珠菌
6～10
B1～B5
热带念珠菌
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11
C
季也蒙念珠菌
12
D
近平滑念珠菌
13
E
乳酒念珠菌
14～18
F1～F5
新型隐球菌
19
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G
克柔念珠菌
20
H
光滑念珠菌
21
I
异常汉逊酵母
22
J
葡萄牙念珠菌
23
K
, http://www.100md.com 红酵母
24
L
白吉利丝孢酵母
25
M
解脂念珠菌
26
V1
红色毛癣菌
27
V2
黄曲霉菌
, http://www.100md.com 28
W1
大肠杆菌
29
W2
金黄色葡萄球菌
所试菌株共17种29株。其中，菌株1至菌株25为酵母菌，除标准菌株外均由解放军总医院微生物科分离并经形态学和生化反应鉴定(VITEKAMSYBC卡、API20CAUX或ID32系统)；V1、V2两种丝状真菌由中国医学真菌保藏管理中心条件致病真菌和产毒真菌专业实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 细菌及真菌培养 酵母菌接种于沙保弱葡萄糖琼脂培养基，25℃24～36h；丝状真菌接种于不含抗生素的沙氏斜面，25℃5～7d；细菌接种于营养琼脂培养基，37℃24h。
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1.2.2 DNA提取 ①细菌：按分子生物学实验指南[7]的碱裂解法裂解细菌，再用酚-氯仿抽提纯化DNA；②真菌：采用HengZhu等[8]介绍的氯化苄提取法并略作修改。
1.2.3 PCR扩增 反应体积为25μl，各引物使用以下扩增条件：10mmol/LTris-HClpH9.2，50mm
ol/LKCl,MgCl2浓度分别为3.0mmol/L(引物Ⅰ、Ⅱ)、2.5mmol/L(引物Ⅲ、Ⅳ)；dATP、dCTP、dGTP、dTTP各100μmol/L；1UTaqDNA多聚酶；4μmol/L引物；10ng模板DNA。PCR循环参照Williams[4]的方案略作修改，具体为：94℃预变性5min；94℃变性1min，40℃复性1min，72℃延伸2min，共45个循环；72℃延伸10min。采用同一引物扩增均重复3次以上。
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1.2.4 扩增产物分析 扩增产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳或5.8%聚丙烯凝胶电泳后再经溴化乙啶染色，用紫外分析仪观察结果并照相。电泳时以λDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker为DNA标准。
1.2.5 结果处理 扩增结果采用CLAUDE[9]等介绍的方法计算相似系数(SAB)。公式如下：
SAB＝2E/(2E+a+b)
其中： E.两种菌共有的带数；
a.A菌独有的带数；
b.B菌独有的带数。
2 结 果
2.1 引物的选择 引物Ⅰ、Ⅱ参考有关文献确定序列。另外，采用Operon公司随机引物试剂盒OPA中的20条引物对菌株A1进行了扩增。结果表明OPA-4和OPA-10两条引物具有较丰富的扩增条带，分别选作引物Ⅲ和引物Ⅳ。
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2.2 不同种间RAPD图型的变异 引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ对13种酵母菌的扩增结果理想。各菌种的扩增产物在数量及大小上均有其自身特征。不同种间的酵母菌其扩增结果有明显差异，由此可将它们区分开来。计算不同种间的相似系数，分别为：引物Ⅰ(0～0.67)、引物Ⅱ(0.25～0.70)、引物Ⅳ(0～0.61)。而引物Ⅲ的扩增结果中种间差异过小，有些甚至无法区分。计算种间相似系数为0.28～0.91之间。因此，不宜作为种间鉴定的引物。
图1 引物Ⅰ对13种酵母菌的扩增结果
2.3 种内RAPD图型的变异 使用引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ分别对5株白念珠菌、5株热带念珠菌和5株新型隐球菌进行了扩增，以观察种内指纹图型的变异情况(图2)。种内变异系数白念珠菌为0.89～1.0之间，热带念珠菌为0.75～1.0之间，新型隐球菌为0.77～1.0之间(引物Ⅱ扩增菌株F3除外)。
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图2 引物Ⅱ扩增白念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌各5株结果
2.4 酵母菌与丝状真菌及细菌的比较 将酵母菌与丝状真菌(红色毛癣菌和黄曲霉菌)及细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)同时扩增。结果表明，所试酵母菌与丝状真菌及细菌间的指纹图型有明显差异(图3)。计算相似系数，酵母菌与丝状真菌间为0～0.63，与细菌间为0～0.52。
图3 引物Ⅰ扩增酵母菌、丝状真菌及细菌的结果
3 讨 论
近年来，临床上酵母菌的感染有增加的趋势。特别是念珠菌，更成为医源性感染的常见病原菌之一[10，11]。尽管白念珠菌仍为念珠菌感染的主要菌种，但不同部位的感染在菌种分布上有多样化的趋势[12]，且不同菌种对抗真菌药物的敏感性不同。因此实验室及时、准确的病原学诊断对酵母菌感染的治疗有着重要的作用。
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3.1 RAPD对酵母菌进行种间分析 引物的选择对RAPD的分析结果有很大的影响，不同引物对酵母菌的鉴定效能是不同的。因此，要达到鉴定的目的首先应当选择合适的引物序列。我们所选用的引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ对所试的酵母菌均具有较好的鉴定效能。它们扩增结果的种间变异远大于种内变异。因此，选择合适引物通过RAPD分析鉴定酵母菌的方法是可行的。
值得注意的是，不同引物对不同菌的鉴定效能有所不同。另外，同一菌种使用不同引物进行扩增时的表现也有所不同。因此，不同的鉴定目的也应选取合适的引物。
3.2 RAPD对同种酵母菌的分析 RAPD分析念珠菌时，同种内不同菌株间的差异能够明显地反映出来[13～15]。我们的结果也反映出这一点。因此，在同种酵母菌分型及酵母菌流行病学研究方面，RAPD均能发挥其作用。同时，采用RAPD技术鉴定酵母菌时除需选择合适的引物及优化、统一实验条件外，尚应考虑各菌种内不同菌株间的差异。LoPasso等[16]与Sorrell[17]等的试验结果表明不同的引物序列及扩增条件对扩增结果有决定性作用，而通过对RAPD图型的分析则可以对临床感染进行相关的流行病学调查。Boekhout等[18]的结果表明，在脉冲场电泳核型产生很大变异的情况下，RAPD图型仍呈现了很好的一致性。而Clemons等[19]的RAPD分析结果则表现出比电泳核型更大的变异。我们的实验结果表明，使用不同引物所获得的种内变异是不同的。因此，进行种间鉴定时选择合适的引物以降低种内变异是完全可能的。同时，在用于菌种鉴定前应尽可能多地了解所用引物在进行RAPD分析时的指纹图型特征。还可同时应用多条引物进行分析，以增加鉴定的可靠性。
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3.3 RAPD用于临床分离酵母菌的鉴定 对酵母菌种间差异的RAPD分析结果表明，在选取了合适引物及实验条件的情况下，RAPD能够将不同种的酵母菌有效地区分开来。同时，尚能弥补常规方法的许多不足之处。通过实验选择合适的引物用于酵母菌的鉴定，可进一步提高鉴定的敏感性和可靠性。另外，有些酵母菌具有很明显的形态和生化反应生物特征。如红酵母在沙氏培养基上的生长菌落为红色等。在鉴定时可将待测菌种的多方面特征结合起来，以达到快速、准确的目的。■
作者简介：杨继勇，男，1969-02-10生，辽宁西丰人，汉族，1998年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院微生物科医师。电话：(010)66939874
参考文献：
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收稿日期：1999-09-27
改回日期：1999-10-24, 百拇医药
单位：解放军总医院微生物科，北京 100853
关键词：随机扩增多态性DNA；酵母菌；多聚酶链反应
军医进修学院学报000125摘 要：目的：应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对临床上常见的酵母菌进行分析，以选择合适的引物和实验条件对酵母菌进行鉴定。方法：选用四条长度为10个碱基的随机引物分别对酵母菌、丝状真菌及细菌进行扩增，并对扩增结果进行相似性分析。结果：所选三条引物可在种的水平上将所试菌株有效地区分开来，但同一引物对不同菌种的扩增结果存在明显的差异。在扩增同种内不同菌株时，各菌株间也存在着一定的差异。采用不同引物进行扩增时种内变异的程度有所不同。除个别菌株外，扩增所得指纹图型的种类差异远远小于不同的菌种间的差异，因而可将不同种的酵母菌有效地区分开来。结论：RAPD技术可用于酵母菌的种间鉴定。其中引物及实验条件的选择尤为重要，同时，将多条引物扩增结果共同用于结果分析将有助于提高鉴定的可靠性。
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中图号：R379 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0073-76
The preliminary study for the identification of yeasts by RAPD
YANG Ji-yong, ZHOU Gui-min, XIE Ling
(Department of Microbiology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective：To analysis DNA polymorphism in different species and strains of the medically important yeasts by random amplified polymorphic DNA (RAPD).Methods：By using four short oligonucleotide primers (10-mers) with arbitrarily chosen sequences in the polymerase chain reaction,we detected 13 different yeasts、2 other fungal species and 2 bacteria. Similarity analysis was also employed.Results：The number and size of the amplification products were characteristic for each species. Interspecies variation was observed within the genus yeasts, and species colud be clearly distinguished by their RAPD profiles. The RAPD profile derived from different primers had distinct diversity. By using same primer, intraspecies DNA length polymorphisms were seen for RAPD profiles and similarity analysis from different species.Especially,the intraspecies polymorphism from Crytococcus neoformans was very obvious. By using different primers,the intraspecies variation of RAPD profiles was different. Except few strains,using primer Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ, the variation among profiles obtained from different strains of the same species was far less than the variation observed among different species of yeasts. So different yeast species could be distinguished by their RAPD profiles.Conclusion：RAPD can be used in the interspecies detection of Yeasts.It is very important to choose primers and experimental conditions. The reliability of detection would be improved by using combinations of oligonucleotide primers.
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Key words：random amplified polymophic DNA; yeasts; polymerase chain reaction▲
近年来，由酵母菌引起的感染有上升的趋势。在感染菌种的分布上，以往以白念珠菌为主，近来非白念珠菌所致感染显著增加。因此，对实验室快速、准确地做出病原学诊断提出了更高的要求[1～3]。随机扩增多态性DNA(RAPD)技术首先由Williams[4]和Welsh[5]等介绍。我们选用4条长度为10个碱基的随机引物对 13 种酵母菌、 2 种丝状真菌和 2 种细菌进行了扩增，得到具有种特异性的RAPD型。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 引物 引物Ⅰ、Ⅱ参照有关文献确定序列，引物Ⅲ、Ⅳ由美国Operon公司随机引物试剂盒A组 20 条引物中选出。 4 条引物均由中国科学院微生物所BECKMAN OLIGO 1000M DNA合成仪合成。
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表1 所用引物来源及序列 编号
来 源
序 列
Ⅰ
Ap3[4]
5′-TCGTAGCCAA-3′
Ⅱ
RP2[6]
5′-AAGGATCAGA-3′
Ⅲ
OPA-4
5′-AATCGGGCTG-3′
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Ⅳ
OPA-10
5′-GTGATCGCAG-3′
1.1.2 实验菌株 见表2。表2 实验菌株 编号
代号
菌 种
1～5
A1～A5
白念珠菌
6～10
B1～B5
热带念珠菌
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11
C
季也蒙念珠菌
12
D
近平滑念珠菌
13
E
乳酒念珠菌
14～18
F1～F5
新型隐球菌
19
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G
克柔念珠菌
20
H
光滑念珠菌
21
I
异常汉逊酵母
22
J
葡萄牙念珠菌
23
K
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24
L
白吉利丝孢酵母
25
M
解脂念珠菌
26
V1
红色毛癣菌
27
V2
黄曲霉菌
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W1
大肠杆菌
29
W2
金黄色葡萄球菌
所试菌株共17种29株。其中，菌株1至菌株25为酵母菌，除标准菌株外均由解放军总医院微生物科分离并经形态学和生化反应鉴定(VITEKAMSYBC卡、API20CAUX或ID32系统)；V1、V2两种丝状真菌由中国医学真菌保藏管理中心条件致病真菌和产毒真菌专业实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 细菌及真菌培养 酵母菌接种于沙保弱葡萄糖琼脂培养基，25℃24～36h；丝状真菌接种于不含抗生素的沙氏斜面，25℃5～7d；细菌接种于营养琼脂培养基，37℃24h。
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1.2.2 DNA提取 ①细菌：按分子生物学实验指南[7]的碱裂解法裂解细菌，再用酚-氯仿抽提纯化DNA；②真菌：采用HengZhu等[8]介绍的氯化苄提取法并略作修改。
1.2.3 PCR扩增 反应体积为25μl，各引物使用以下扩增条件：10mmol/LTris-HClpH9.2，50mm
ol/LKCl,MgCl2浓度分别为3.0mmol/L(引物Ⅰ、Ⅱ)、2.5mmol/L(引物Ⅲ、Ⅳ)；dATP、dCTP、dGTP、dTTP各100μmol/L；1UTaqDNA多聚酶；4μmol/L引物；10ng模板DNA。PCR循环参照Williams[4]的方案略作修改，具体为：94℃预变性5min；94℃变性1min，40℃复性1min，72℃延伸2min，共45个循环；72℃延伸10min。采用同一引物扩增均重复3次以上。
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1.2.4 扩增产物分析 扩增产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳或5.8%聚丙烯凝胶电泳后再经溴化乙啶染色，用紫外分析仪观察结果并照相。电泳时以λDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker为DNA标准。
1.2.5 结果处理 扩增结果采用CLAUDE[9]等介绍的方法计算相似系数(SAB)。公式如下：
SAB＝2E/(2E+a+b)
其中： E.两种菌共有的带数；
a.A菌独有的带数；
b.B菌独有的带数。
2 结 果
2.1 引物的选择 引物Ⅰ、Ⅱ参考有关文献确定序列。另外，采用Operon公司随机引物试剂盒OPA中的20条引物对菌株A1进行了扩增。结果表明OPA-4和OPA-10两条引物具有较丰富的扩增条带，分别选作引物Ⅲ和引物Ⅳ。
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2.2 不同种间RAPD图型的变异 引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ对13种酵母菌的扩增结果理想。各菌种的扩增产物在数量及大小上均有其自身特征。不同种间的酵母菌其扩增结果有明显差异，由此可将它们区分开来。计算不同种间的相似系数，分别为：引物Ⅰ(0～0.67)、引物Ⅱ(0.25～0.70)、引物Ⅳ(0～0.61)。而引物Ⅲ的扩增结果中种间差异过小，有些甚至无法区分。计算种间相似系数为0.28～0.91之间。因此，不宜作为种间鉴定的引物。
图1 引物Ⅰ对13种酵母菌的扩增结果
2.3 种内RAPD图型的变异 使用引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ分别对5株白念珠菌、5株热带念珠菌和5株新型隐球菌进行了扩增，以观察种内指纹图型的变异情况(图2)。种内变异系数白念珠菌为0.89～1.0之间，热带念珠菌为0.75～1.0之间，新型隐球菌为0.77～1.0之间(引物Ⅱ扩增菌株F3除外)。
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图2 引物Ⅱ扩增白念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌各5株结果
2.4 酵母菌与丝状真菌及细菌的比较 将酵母菌与丝状真菌(红色毛癣菌和黄曲霉菌)及细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)同时扩增。结果表明，所试酵母菌与丝状真菌及细菌间的指纹图型有明显差异(图3)。计算相似系数，酵母菌与丝状真菌间为0～0.63，与细菌间为0～0.52。
图3 引物Ⅰ扩增酵母菌、丝状真菌及细菌的结果
3 讨 论
近年来，临床上酵母菌的感染有增加的趋势。特别是念珠菌，更成为医源性感染的常见病原菌之一[10，11]。尽管白念珠菌仍为念珠菌感染的主要菌种，但不同部位的感染在菌种分布上有多样化的趋势[12]，且不同菌种对抗真菌药物的敏感性不同。因此实验室及时、准确的病原学诊断对酵母菌感染的治疗有着重要的作用。
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3.1 RAPD对酵母菌进行种间分析 引物的选择对RAPD的分析结果有很大的影响，不同引物对酵母菌的鉴定效能是不同的。因此，要达到鉴定的目的首先应当选择合适的引物序列。我们所选用的引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ对所试的酵母菌均具有较好的鉴定效能。它们扩增结果的种间变异远大于种内变异。因此，选择合适引物通过RAPD分析鉴定酵母菌的方法是可行的。
值得注意的是，不同引物对不同菌的鉴定效能有所不同。另外，同一菌种使用不同引物进行扩增时的表现也有所不同。因此，不同的鉴定目的也应选取合适的引物。
3.2 RAPD对同种酵母菌的分析 RAPD分析念珠菌时，同种内不同菌株间的差异能够明显地反映出来[13～15]。我们的结果也反映出这一点。因此，在同种酵母菌分型及酵母菌流行病学研究方面，RAPD均能发挥其作用。同时，采用RAPD技术鉴定酵母菌时除需选择合适的引物及优化、统一实验条件外，尚应考虑各菌种内不同菌株间的差异。LoPasso等[16]与Sorrell[17]等的试验结果表明不同的引物序列及扩增条件对扩增结果有决定性作用，而通过对RAPD图型的分析则可以对临床感染进行相关的流行病学调查。Boekhout等[18]的结果表明，在脉冲场电泳核型产生很大变异的情况下，RAPD图型仍呈现了很好的一致性。而Clemons等[19]的RAPD分析结果则表现出比电泳核型更大的变异。我们的实验结果表明，使用不同引物所获得的种内变异是不同的。因此，进行种间鉴定时选择合适的引物以降低种内变异是完全可能的。同时，在用于菌种鉴定前应尽可能多地了解所用引物在进行RAPD分析时的指纹图型特征。还可同时应用多条引物进行分析，以增加鉴定的可靠性。
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3.3 RAPD用于临床分离酵母菌的鉴定 对酵母菌种间差异的RAPD分析结果表明，在选取了合适引物及实验条件的情况下，RAPD能够将不同种的酵母菌有效地区分开来。同时，尚能弥补常规方法的许多不足之处。通过实验选择合适的引物用于酵母菌的鉴定，可进一步提高鉴定的敏感性和可靠性。另外，有些酵母菌具有很明显的形态和生化反应生物特征。如红酵母在沙氏培养基上的生长菌落为红色等。在鉴定时可将待测菌种的多方面特征结合起来，以达到快速、准确的目的。■
作者简介：杨继勇，男，1969-02-10生，辽宁西丰人，汉族，1998年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院微生物科医师。电话：(010)66939874
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收稿日期：1999-09-27
改回日期：1999-10-24, 百拇医药