白血病细胞多巴胺受体基因甲基化研究
作者：于力 王全顺 顾群 史子江 靳海杰
单位：解放军总医院血液科，北京 100853
关键词：白血病；多巴胺受体基因；DNA甲基化
军医进修学院学报000121摘 要：目的：探讨多巴胺受体(DRD4)基因第一外显子中NotⅠ酶切位点甲基化与急性非淋巴细胞白血病(AML)的关系。方法：应用Southern印记杂交及DNA序列分析技术对AML患者骨髓标本进行分析。结果：在 27 例白血病患者骨髓标本中16例DRD4 基因甲基化(59%)，其中初治化疗敏感患者DRD4 基因甲基化发生率为 50% (9/18)，复发及难治患者甲基化发生率为78%(7/9)，而 9 例正常人骨髓标本DRD4 基因均无甲基化。结论：DRD4 基因甲基化在白血病患者发生率明显高于正常人(P<0.05)，而在复发及难治患者其发生率略高于初治化疗敏感患者，DRD4基因甲基化可能与白血病的发生、发展有一定关系。
, http://www.100md.com
中图号：R557 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0062-64
Study on aberrant DNA methylation of dopamine D4 receptor gene in acute myeloid leukemia
YU Li,WANG Quan-shun,GU Qun,SHI Zi-jiang,JIN Hai-jie
(Department of Hematology,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
Abstract：Objective：To investigate aberrant DNA methylation of Not I site on exon I of dopamine D4 receptor (DRD4) gene in acute myeloid leukemia (AML).Methods：Southern Blot and DNA sequencing technique were performed on DNA from AML bone marrow samples.Results：Sixteen samples from 27 AML patients (59%) showed DNA methylation of DRD4 gene. Nine samples from 18 diagnostic chemosensitive patients (50%) and 7 samples from 9 refractory and relapse AML patients (78%) showed DNA methylation. But 9 normal bone marrow samples did not show any DNA methylation on DRD4 gene.Conclusion：The incidence of DRD4 gene methylation in AML was significantly higher than that in normal bone marrow (P<0.05). There is potential importance of DRD4 gene methylation in initiation and development of AML.
, 百拇医药
Key words：AML; DRD4 gene; DNA methylation▲
我们应用限制性酶切基因扫描技术(restriction landmark genomic scanning, RLGS)[1]，自 1 例急性非淋巴细胞白血病(AML)细胞中克隆白血病相关基因过程中，发现一长度为 779 bp 的NotⅠ-HinfⅠ酶切DNA片断，经DNA序列分析表明此片段来源于多巴胺受体(DRD4)基因的第一外显子和第一内含子(另文发表)。用此片段作为探针，用Southern Blot技术对DRD4基因在AML及正常骨髓中的甲基化情况进行了分析。
1 材料和方法
1.1 标本 标本来源于按FAB标准诊断的急性非淋巴细胞白血患者的骨髓及正常人骨髓，DNA提取按文献介绍方法[2]。
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1.2 PCR产物序列分析 PCR引物Ⅰ：5′-AACTCGCTCGTGTGCGTGAG-3′，PCR引物Ⅱ：5′-CCGGGGTCCCTGGATAGAAG-3′。引物Ⅰ起始于DRD4基因的630bp处，引物Ⅱ：终止于1049bp处，PCR产物跨越NotⅠ酶切位点，长度为420bp。应用TACloning试剂盒(Invitrogen)，按说明将PCR产物连接到质粒载体中并转染到大肠杆菌内。扩增及提取质粒DNA，用自动序列分析仪测序。
1.3 探针的制备 质粒由美国俄亥俄大学肿瘤研究所MichaelCaligiuri教授惠赠，其中含有779bp长的来源于DRD4基因部分第一外显子和内含子的NotⅠ-HinfⅠDNA片段。质粒的扩增及提取按文献介绍方法[2]。3μg质粒DNA经限制性内切酶消化37℃2h，1.5%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，在长波紫外线下切取含有长度的779bp的DNA片段的凝胶，用DNA纯化柱(Qiagen)按说明获得用做探针的DNA片段，经P32标记后进行杂交。
, 百拇医药
1.4 Southern印记杂交 基因组DNA5μg用限制性内切酶NotⅠ单独及NotⅠ和EcoRV双酶解37℃3h，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，转移DNA至尼龙膜。用标有P32的探针杂交及放射自显影[2]。
1.5 统计方法 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 白血病不同病期标本DRD4基因NotⅠ酶切位点分析 对1例急性非淋巴细胞白血患者不同病期(初治、缓解、复发)的骨髓标本，用来源于DRD4基因的779bp长的DNA片段作为探针进行Southern印记杂交分析(附图)。在对照组(正常骨髓)中，EcoRV单酶解标本可见一条6.5kb长的杂交带，而EcoRV与甲基化敏感酶NotⅠ双酶解标本此带消失；在初治和缓解组中，可见与对照组类似结果；而在复发组中见两条相同长度的带。结果表明甲基化敏感酶在正常骨髓、白血病初治及缓解骨髓可以切开DRD4基因中第一外显子的NotⅠ酶切位点，而在白血病复发标本NotⅠ酶切位点不能被切开。
, 百拇医药
附图 Southern印记杂交结果
在正常骨髓(Nbm)、初治(Dia)及缓解(Rem)组，EcoRV单酶解标本可见一条6.5kb杂交带，EcoRV/NotⅠ双酶解标本此带消失；而在复发(Rel)组见两条相同长度的杂交带，探针来源于DRD4基因点克隆DNA片段
2.2 白血病复发期标本DRD4基因NotⅠ酶切位点DNA序列分析 应用PCR技术对这例患者复发期骨髓标本进行扩增获得一长度为420bp跨越DRD4基因中NotⅠ酶切位点的DNA片段，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，自凝胶中纯化该片段。将这一片段连接到质粒载体中并转染至大肠杆菌体内，扩增及提取质粒DNA，用自动序列分析仪进行DNA序列分析。结果表明DRD4基因第一外显子内的NotⅠ酶切位点存在，此处无点突变及缺失。结合Southern印记杂交及DNA序列分析结果表明在复发标本中位于此处的NotⅠ酶切位点发生了甲基化。
2.3 白血病及正常骨髓标本DRD4基因甲基化检测 用Southern印记杂交技术检测对白血病及正常骨髓标本DRD4基因第一外显子NotⅠ酶切位点处DNA甲基化情况进行了检测。9例正常骨髓标本此处均无甲基化，而27例AML患者骨髓标本中16例(59%)DRD4基因发生了甲基化，经统计学处理两组有显著差异(P<0.05)。18例初治敏感标本中9例(50%)发生甲基化；9例复发及原发难治标本中7例(78%)发生甲基化(附表)，DRD4基因甲基化发生率虽高于初治敏感组，但尚无统计学意义(P>0.05)。另外，目前我们正在用5种甲基化敏感酶NotⅠ、BssH、SmaⅠ、HpaⅡ、HhaⅠ结合，对白血病细胞DRD4基因第一外显子处甲基化范围进行检测，结果待另文发表。
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附表 DRD4基因DNA甲基化检测结果 标本
甲基化
甲基化率
(%)
+
-
合计
正 常
0
9
9
0
初 治
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9
9
18
50
复发、难治
7
2
9
78
3 讨 论
多巴胺受体(DR)由5个家族成员组成，分别命名为DRD1、DRD2、DRD3、DRD4及DRD5，常与某些精神、神经疾病有关，如精神分裂症、早发性痴呆等。但最新研究表明多巴胺受体与肿瘤细胞多药耐药有关[3，4]。DRD4是具有代表性的多巴胺受体之一，编码这一受体蛋白的基因位于第11号染色体短臂，DRD4基因的全长约4kb，由5个外显子组成[5]。
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本研究首次报道了DRD4基因在AML白血病细胞中DNA甲基化情况，并进一步发现DNA甲基化在复发及难治AML患者发生率略高于初治敏感患者，而在正常骨髓细胞中无甲基化发生。白血病复发目前认为是由于在诱导及巩固治疗中产生的耐药性白血病细胞株再次增殖所致，原发难治白血病是指白血病细胞在治疗前就已对化疗药物具有耐受性，复发及原发难治白血病某种程度上在耐药方面具有共同的分子水平异常特征。目前我们正在对DNA甲基化与这一基因表达调控的关系及临床意义进行深入的研究，以探讨其在白血病发生、发展中的作用。
DRD4基因位于11号染色体短臂，11号染色体短臂被认为是肿瘤细胞DNA甲基化高发区(HotSpot)[6]。DNA甲基化是指DNA上CpG双核苷中的胞嘧啶(Cytocine,C)处于甲基化状态，DNA甲基化在DNA修复、基因稳定及基因表达调控方面均起重要作用，DNA甲基化模式的改变可导致基因结构和功能的异常，是细胞癌变中重要的一环[7]。肿瘤细胞中某些表达基因5′端启动子区CpG岛甲基化是基因表达调控方式之一，在正常情况下这些部位不被甲基化，启动子区DNA甲基化可导致抗癌基因的失活，已有关于具有抗癌功能的基因p15及雌激素受体基因在白血病中高甲基化的报道[8，9]。5-杂氮-2′-脱氧胞嘧啶(5-aza-2′-deoxycytidine)，是去甲基化治疗药物，可使启动子区DNA去甲基化，恢复肿瘤抑制基因表达，可激活肿瘤抑制基因p15的表达，抑制肿瘤的细胞生长，目前已被作为治疗肿瘤药物应用于临床[10]。肿瘤相关基因DNA甲基化及去甲基化研究越来月引起人们的重视。■
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基金项目：“九五”军队科研基金项目(98M141)；
作者简介：于力，男，1958-03-07生，吉林省白城市人，汉族。1994年中国协和医科大学博士毕业，解放军总医院血液科副主任医师，副教授，科室副主任，发表论文20篇。电话：(010)66939481
参考文献：
[1]Costello JF, Plass C, Arap W et al. Cyclin dependent kinase 6 (CDK6) amplification in human glioblastomas identified using two-dimensional separation of genomic DNA [J]. Cancer Res, 1997,57(7):1250-1254.
[2]Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual [C]. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab Press: Plainvies NY, 1989.
, http://www.100md.com
[3]Chio CL, Drong RL, Riley RF et al. D4 dopamine receptor-mediated signaling events determined in transfected chinese hamster ovary cells [J]. J Biol Chem, 1994,269(16):11813-11819.
[4]Furuya KN, Thottassery JV, Schuetz EG et al. Bromocriptine transcriptionally activates the multidrug resistance gene (pgp/mdr1b) by a novel pathway [J]. J Biol Chem, 1997,272(17):11518-11525.
[5]Kamakura S, Iwaki A, Matrumoto M et al. Cloning and characterization of the 5′-flanking region of the human dopamine D4 receptor gene. Biochem Biophys Res Commun [J], 1997,235(2):321-326.
, 百拇医药
[6]De Bustros A, Nelkin BD, Silverman A et al. The short arm of chromosome 11 is a “hot Spot” for hypermethylation in human neoplasia [J]. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1988,85(15):5693-5697.
[7]Baylin SB, Herman JG, Graff JR et al. Alterations in DNA methylation: A fundamental aspect of neoplasia [J]. Adv Cancer Res, 1998,72:141-196.
[8]Herman JG, Civin CI, Issa JP et al. Distinct patterns of inactivation of p15INK4Band p16INK4A characterize the major types of hematological maliganancies [J]. Cancer Res, 1997,57(1):837-841.
, 百拇医药
[9]Issa JP, Zehnbauer BA, Civin CI et al. The estrogen receptor CpG island is methylated in most hematopoietic neoplasms [J]. Cancer Res, 1996,56(5):973-977.
[10]Momparler RL, Cote S, Eliopoulos N et al. Pharmacological approach for optimization of the dose schedule of 5-aza-2′-deoxycytidine (Decitabine) for the therapy of leukemia [J].Leukemia,1997,11(2):175-180.
收稿日期：1999-07-09
改回日期：1999-08-10, http://www.100md.com
单位：解放军总医院血液科，北京 100853
关键词：白血病；多巴胺受体基因；DNA甲基化
军医进修学院学报000121摘 要：目的：探讨多巴胺受体(DRD4)基因第一外显子中NotⅠ酶切位点甲基化与急性非淋巴细胞白血病(AML)的关系。方法：应用Southern印记杂交及DNA序列分析技术对AML患者骨髓标本进行分析。结果：在 27 例白血病患者骨髓标本中16例DRD4 基因甲基化(59%)，其中初治化疗敏感患者DRD4 基因甲基化发生率为 50% (9/18)，复发及难治患者甲基化发生率为78%(7/9)，而 9 例正常人骨髓标本DRD4 基因均无甲基化。结论：DRD4 基因甲基化在白血病患者发生率明显高于正常人(P<0.05)，而在复发及难治患者其发生率略高于初治化疗敏感患者，DRD4基因甲基化可能与白血病的发生、发展有一定关系。
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中图号：R557 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0062-64
Study on aberrant DNA methylation of dopamine D4 receptor gene in acute myeloid leukemia
YU Li,WANG Quan-shun,GU Qun,SHI Zi-jiang,JIN Hai-jie
(Department of Hematology,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
Abstract：Objective：To investigate aberrant DNA methylation of Not I site on exon I of dopamine D4 receptor (DRD4) gene in acute myeloid leukemia (AML).Methods：Southern Blot and DNA sequencing technique were performed on DNA from AML bone marrow samples.Results：Sixteen samples from 27 AML patients (59%) showed DNA methylation of DRD4 gene. Nine samples from 18 diagnostic chemosensitive patients (50%) and 7 samples from 9 refractory and relapse AML patients (78%) showed DNA methylation. But 9 normal bone marrow samples did not show any DNA methylation on DRD4 gene.Conclusion：The incidence of DRD4 gene methylation in AML was significantly higher than that in normal bone marrow (P<0.05). There is potential importance of DRD4 gene methylation in initiation and development of AML.
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Key words：AML; DRD4 gene; DNA methylation▲
我们应用限制性酶切基因扫描技术(restriction landmark genomic scanning, RLGS)[1]，自 1 例急性非淋巴细胞白血病(AML)细胞中克隆白血病相关基因过程中，发现一长度为 779 bp 的NotⅠ-HinfⅠ酶切DNA片断，经DNA序列分析表明此片段来源于多巴胺受体(DRD4)基因的第一外显子和第一内含子(另文发表)。用此片段作为探针，用Southern Blot技术对DRD4基因在AML及正常骨髓中的甲基化情况进行了分析。
1 材料和方法
1.1 标本 标本来源于按FAB标准诊断的急性非淋巴细胞白血患者的骨髓及正常人骨髓，DNA提取按文献介绍方法[2]。
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1.2 PCR产物序列分析 PCR引物Ⅰ：5′-AACTCGCTCGTGTGCGTGAG-3′，PCR引物Ⅱ：5′-CCGGGGTCCCTGGATAGAAG-3′。引物Ⅰ起始于DRD4基因的630bp处，引物Ⅱ：终止于1049bp处，PCR产物跨越NotⅠ酶切位点，长度为420bp。应用TACloning试剂盒(Invitrogen)，按说明将PCR产物连接到质粒载体中并转染到大肠杆菌内。扩增及提取质粒DNA，用自动序列分析仪测序。
1.3 探针的制备 质粒由美国俄亥俄大学肿瘤研究所MichaelCaligiuri教授惠赠，其中含有779bp长的来源于DRD4基因部分第一外显子和内含子的NotⅠ-HinfⅠDNA片段。质粒的扩增及提取按文献介绍方法[2]。3μg质粒DNA经限制性内切酶消化37℃2h，1.5%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，在长波紫外线下切取含有长度的779bp的DNA片段的凝胶，用DNA纯化柱(Qiagen)按说明获得用做探针的DNA片段，经P32标记后进行杂交。
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1.4 Southern印记杂交 基因组DNA5μg用限制性内切酶NotⅠ单独及NotⅠ和EcoRV双酶解37℃3h，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，转移DNA至尼龙膜。用标有P32的探针杂交及放射自显影[2]。
1.5 统计方法 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 白血病不同病期标本DRD4基因NotⅠ酶切位点分析 对1例急性非淋巴细胞白血患者不同病期(初治、缓解、复发)的骨髓标本，用来源于DRD4基因的779bp长的DNA片段作为探针进行Southern印记杂交分析(附图)。在对照组(正常骨髓)中，EcoRV单酶解标本可见一条6.5kb长的杂交带，而EcoRV与甲基化敏感酶NotⅠ双酶解标本此带消失；在初治和缓解组中，可见与对照组类似结果；而在复发组中见两条相同长度的带。结果表明甲基化敏感酶在正常骨髓、白血病初治及缓解骨髓可以切开DRD4基因中第一外显子的NotⅠ酶切位点，而在白血病复发标本NotⅠ酶切位点不能被切开。
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附图 Southern印记杂交结果
在正常骨髓(Nbm)、初治(Dia)及缓解(Rem)组，EcoRV单酶解标本可见一条6.5kb杂交带，EcoRV/NotⅠ双酶解标本此带消失；而在复发(Rel)组见两条相同长度的杂交带，探针来源于DRD4基因点克隆DNA片段
2.2 白血病复发期标本DRD4基因NotⅠ酶切位点DNA序列分析 应用PCR技术对这例患者复发期骨髓标本进行扩增获得一长度为420bp跨越DRD4基因中NotⅠ酶切位点的DNA片段，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，自凝胶中纯化该片段。将这一片段连接到质粒载体中并转染至大肠杆菌体内，扩增及提取质粒DNA，用自动序列分析仪进行DNA序列分析。结果表明DRD4基因第一外显子内的NotⅠ酶切位点存在，此处无点突变及缺失。结合Southern印记杂交及DNA序列分析结果表明在复发标本中位于此处的NotⅠ酶切位点发生了甲基化。
2.3 白血病及正常骨髓标本DRD4基因甲基化检测 用Southern印记杂交技术检测对白血病及正常骨髓标本DRD4基因第一外显子NotⅠ酶切位点处DNA甲基化情况进行了检测。9例正常骨髓标本此处均无甲基化，而27例AML患者骨髓标本中16例(59%)DRD4基因发生了甲基化，经统计学处理两组有显著差异(P<0.05)。18例初治敏感标本中9例(50%)发生甲基化；9例复发及原发难治标本中7例(78%)发生甲基化(附表)，DRD4基因甲基化发生率虽高于初治敏感组，但尚无统计学意义(P>0.05)。另外，目前我们正在用5种甲基化敏感酶NotⅠ、BssH、SmaⅠ、HpaⅡ、HhaⅠ结合，对白血病细胞DRD4基因第一外显子处甲基化范围进行检测，结果待另文发表。
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附表 DRD4基因DNA甲基化检测结果 标本
甲基化
甲基化率
(%)
+
-
合计
正 常
0
9
9
0
初 治
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9
9
18
50
复发、难治
7
2
9
78
3 讨 论
多巴胺受体(DR)由5个家族成员组成，分别命名为DRD1、DRD2、DRD3、DRD4及DRD5，常与某些精神、神经疾病有关，如精神分裂症、早发性痴呆等。但最新研究表明多巴胺受体与肿瘤细胞多药耐药有关[3，4]。DRD4是具有代表性的多巴胺受体之一，编码这一受体蛋白的基因位于第11号染色体短臂，DRD4基因的全长约4kb，由5个外显子组成[5]。
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本研究首次报道了DRD4基因在AML白血病细胞中DNA甲基化情况，并进一步发现DNA甲基化在复发及难治AML患者发生率略高于初治敏感患者，而在正常骨髓细胞中无甲基化发生。白血病复发目前认为是由于在诱导及巩固治疗中产生的耐药性白血病细胞株再次增殖所致，原发难治白血病是指白血病细胞在治疗前就已对化疗药物具有耐受性，复发及原发难治白血病某种程度上在耐药方面具有共同的分子水平异常特征。目前我们正在对DNA甲基化与这一基因表达调控的关系及临床意义进行深入的研究，以探讨其在白血病发生、发展中的作用。
DRD4基因位于11号染色体短臂，11号染色体短臂被认为是肿瘤细胞DNA甲基化高发区(HotSpot)[6]。DNA甲基化是指DNA上CpG双核苷中的胞嘧啶(Cytocine,C)处于甲基化状态，DNA甲基化在DNA修复、基因稳定及基因表达调控方面均起重要作用，DNA甲基化模式的改变可导致基因结构和功能的异常，是细胞癌变中重要的一环[7]。肿瘤细胞中某些表达基因5′端启动子区CpG岛甲基化是基因表达调控方式之一，在正常情况下这些部位不被甲基化，启动子区DNA甲基化可导致抗癌基因的失活，已有关于具有抗癌功能的基因p15及雌激素受体基因在白血病中高甲基化的报道[8，9]。5-杂氮-2′-脱氧胞嘧啶(5-aza-2′-deoxycytidine)，是去甲基化治疗药物，可使启动子区DNA去甲基化，恢复肿瘤抑制基因表达，可激活肿瘤抑制基因p15的表达，抑制肿瘤的细胞生长，目前已被作为治疗肿瘤药物应用于临床[10]。肿瘤相关基因DNA甲基化及去甲基化研究越来月引起人们的重视。■
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基金项目：“九五”军队科研基金项目(98M141)；
作者简介：于力，男，1958-03-07生，吉林省白城市人，汉族。1994年中国协和医科大学博士毕业，解放军总医院血液科副主任医师，副教授，科室副主任，发表论文20篇。电话：(010)66939481
参考文献：
[1]Costello JF, Plass C, Arap W et al. Cyclin dependent kinase 6 (CDK6) amplification in human glioblastomas identified using two-dimensional separation of genomic DNA [J]. Cancer Res, 1997,57(7):1250-1254.
[2]Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual [C]. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab Press: Plainvies NY, 1989.
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[3]Chio CL, Drong RL, Riley RF et al. D4 dopamine receptor-mediated signaling events determined in transfected chinese hamster ovary cells [J]. J Biol Chem, 1994,269(16):11813-11819.
[4]Furuya KN, Thottassery JV, Schuetz EG et al. Bromocriptine transcriptionally activates the multidrug resistance gene (pgp/mdr1b) by a novel pathway [J]. J Biol Chem, 1997,272(17):11518-11525.
[5]Kamakura S, Iwaki A, Matrumoto M et al. Cloning and characterization of the 5′-flanking region of the human dopamine D4 receptor gene. Biochem Biophys Res Commun [J], 1997,235(2):321-326.
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[6]De Bustros A, Nelkin BD, Silverman A et al. The short arm of chromosome 11 is a “hot Spot” for hypermethylation in human neoplasia [J]. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1988,85(15):5693-5697.
[7]Baylin SB, Herman JG, Graff JR et al. Alterations in DNA methylation: A fundamental aspect of neoplasia [J]. Adv Cancer Res, 1998,72:141-196.
[8]Herman JG, Civin CI, Issa JP et al. Distinct patterns of inactivation of p15INK4Band p16INK4A characterize the major types of hematological maliganancies [J]. Cancer Res, 1997,57(1):837-841.
, 百拇医药
[9]Issa JP, Zehnbauer BA, Civin CI et al. The estrogen receptor CpG island is methylated in most hematopoietic neoplasms [J]. Cancer Res, 1996,56(5):973-977.
[10]Momparler RL, Cote S, Eliopoulos N et al. Pharmacological approach for optimization of the dose schedule of 5-aza-2′-deoxycytidine (Decitabine) for the therapy of leukemia [J].Leukemia,1997,11(2):175-180.
收稿日期：1999-07-09
改回日期：1999-08-10, http://www.100md.com