促炎及抗炎细胞因子在脓毒症肺损伤中的作用
作者：吴荣谦 宋旭华 徐迎新 孟宪钧
单位：解放军总医院普外研究所，北京 100853
关键词：细胞因子；脓毒症；肺损伤
军医进修学院学报000105 摘 要：目的：探索促炎症及抗炎症细胞因子在脓毒症肺损伤中的作用。方法：采用RT-PCR的方法比较了脓毒症小鼠肺组织中多种细胞因子(促炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6，抗炎症细胞因子IL-4) mRNA的表达。结果：盲肠结扎穿孔(CLP)后3h TNFα、IL-1β的表达即明显增高，12h 虽有所降低但仍明显高于假手术(sham)组；IL-6 基因在CLP后3h 亦明显增高，至12h 似有进一步增高的趋势；而IL-4 基因在sham组和CLP组中均有表达，各组间无明显差异。结论：促炎症细胞因子与抗炎症细胞因子之间力量对比的失衡可能是脓毒症并发肺损伤的重要原因。
, http://www.100md.com 中图号：R329 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0014-16
The role of pro- and anti-inflammatory cytokine in sepsis induced lung injury
WU Rong-qian, SONG Xu-hua, XU Ying-xin,MENG Xian-jun
(Institute of Surgical Research, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective：To investigate the role of Pro-and Anti-inflammatory cytokine in sepsis induced lung injury. Methods：Sepsis was induced in mice by cecal ligation and puncture (CLP). Sham operation group underwent the same manipulation but without CLP. Pro-inflammatory cytokine (TNFα, IL-1β, IL-6) and Anti-imflammatory cytokine (IL-4) gene expression of lung tissue were assessed by RT-PCR.Results：A significant increase in TNF, IL-1 and IL-6 gene expression was observed at 3 and 12 hours after CLP. The level of TNFα and IL-1β at 3 hours was higher than 12 hours, and the level of IL-6 gene expression at 12 hours was slightly higher than 3 hours. While no difference was seen in IL-4 gene expression between CLP and sham group.Conclusion：The unbalance of pro-and anti-inflammatory cytokine may play a key role in the development of sepsis induced lung injury.
, 百拇医药
Key words：cytokine; sepsis; lung injury▲
脓毒症及常常并发的多器官功能失常综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，救治棘手、死亡率高，一直是外科医生所面对的难题[1]。对其发病机制目前尚不完全清楚，但一般认为细胞因子在其中具有重要的作用[2]。在以往的研究中对典型的促炎症细胞因子如TNFα、IL-1β已有不少报道，认为高水平的TNFα、IL-1β是导致炎症反应过度持久和器官功能受损的重要因素，并依此进行了抗炎症治疗的尝试，但结果发现其无益甚至有害[3]。于是人们开始意识到机体自身抗炎症反应的重要性，提出MODS发生中免疫失衡的观点[4]。作者利用脓毒症小鼠模型，在不同时相同时观察肺组织中促炎症与抗炎症细胞因子在基因水平的表达变化，以探讨MODS发生的基础并寻求可能的防治途径。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 脓毒症模型制作 选用雄性昆明小鼠，体重18～22g，由解放军总医院实验动物中心提供，随机分为两组：盲肠结扎穿孔组(cecal ligation and perforation, 简称CLP组)和假手术组(简称Sham组)，设两个时间点(3和12h)每时间点6只。
1.2 心肺系数及病理形态学观察 开胸取心肺，并称其湿重，计算心肺系数，心肺系数＝肺湿重(g)/心湿重(g)。肉眼观察肺部病变后，常规福尔马林固定、石蜡切片、HE染色。
1.3 细胞因子基因表达检测 采用异硫氰酸胍一步法提取肺组织中的总RNA，紫外分光光度计定量，取1μgRNA在逆转录酶的作用下合成cDNA。以β-actin或β2-MG为内对照基因扩增细胞因子基因。所用引物序列如下：β-actin(内对照基因，478bp)5′AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA3′，5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA3′；β2-MG(内对照基因，300bp)：5′GGCTCGCTCGGTGA-CCCTAGTCTTT3′，5′TCTGCAGGCGTATGT-ATCAGTCTCA3′；TNF-α(349bp)：5′TTCTGTCCCTTTCACTCACTGG3′，5′TTGGTGGT-TTGCTACGACGTGG3′，IL-1β(441bp):5′ATTAGACAGCTGCACTACAGGCTC3′，5′AGATTCCATGGTGAAGTCAATTAT3′；IL-6(156bp):5′TGGAGTCACAGAAGGAGTGGC-TAAG3′，5′TCTGACCACAGTGAGGAATGT-CCAC3′；IL-4(181bp)：5′CGAAGAACACCACAGAGAGTGAGCT3′，5′GACTCATTCATGGTGCAGCTTATCG3′。PCR反应体系为25μl，反应条件：95℃变性5min后，按94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。取PCR反应产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用PBR322/HinfⅠ做分子量标准来判断PCR产物片断大小，EB染色，紫外灯下观察并照相。底片在密度扫描仪上定量，以目的基因扩增量/内对照基因扩增量表示所要检测基因的表达量。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 所有数据均以平均值±标准差(
±s)表示，用t检验进行统计学分析。
2 结 果
2.1 肺部病理检查 肉眼检查发现Sham组肺呈淡粉红色，无充血、出血、水肿，CLP后3h小鼠肺部呈暗红色，可见显著的肿胀、充血，至12h更为明显，切面有泡沫状血性液体流出；光镜检查Sham组仅可见轻度充血未见出血现象，而CLP组可见严重的肺水肿和广泛的出血，并有明显的白细胞聚集。
2.2 心肺系数改变 Sham组与CLP组比较，CLP后3h心肺系数即明显增高，至12h虽有进一步增高的趋势但与CLP后3h比较差异无显著性意义(表1)。
表1 各组间心肺系数比较(n=6,±s)
, http://www.100md.com
心肺系数
Sham组3h
1.2917±0.0815
CLP组3h
1.4418±0.0522**
Sham组12h
1.3462±0.0967
CLP组12h
1.5186±0.1003*
与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01
, http://www.100md.com
2.3 肺组织细胞因子表达 CLP后3hTNFα、IL-1β基因表达即明显增高，至12h虽有所降低但仍明显高于Sham组，统计学有显著性差异。IL-6基因的表达与TNFα、IL-1β稍有不同：Sham组IL-6有弱表达，CLP后3h明显增高，至12h仍维持在高水平。IL-4基因在Sham组和CLP组中均有表达，各组间差异无显著性意义(表2)。表2 各组间细胞因子mRNA表达比较(n=6,±s)
TNFα
IL-1β
IL-6
IL-4
Sham组3h
0.2918±0.0487
, 百拇医药
0.3188±0.0766
0.4557±0.0980
0.4151±0.0826
CLP组3h
0.7213±0.0875**
0.8573±0.1214**
0.9988±0.2234**
0.4281±0.0763
Sham组12h
0.3003±0.0826
, 百拇医药
0.3330±0.1051
0.4085±0.1059
0.4560±0.0686
CLP组12h
0.6253±0.0717**
0.6732±0.0877**
1.0433±0.1438**
0.4773±0.0970
与Sham组比较，**P<0.01
3 讨 论
, 百拇医药
在脓毒症并发的多器官损伤中，肺脏常常是最多受累的器官。本研究也发现脓毒症时肺脏损伤明显。一般认为它的发生与机体过度的炎症反应密切相关，但对这一炎症反应的规律与机制尚缺乏明确、肯定的认识。由于肺脏是巨噬细胞较为集中的器官，而巨噬细胞是细胞因子的主要来源之一，因此血液中细胞因子的水平很难准确反映肺组织局部的炎症反应程度。本实验用盲肠结扎穿孔(CLP)的方法制做小鼠脓毒症模型，直接观察了脓毒症时肺组织中促炎症与抗炎症细胞因子基因的表达，结果发现脓毒症时肺组织中促炎症细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6的表达均明显增高而抗炎症细胞因子IL-4的表达却无明显改变。TNFα是机体受到有害刺激后最初分泌的细胞因子，它可诱导其它多种因子的产生，如IL-1β可由内毒素直接刺激产生也可由TNFα诱导产生，升高后的IL-1β可与TNFα协同作用共同刺激IL-6的产生。这些促炎症细胞因子之间相互作用可形成许多正反馈环，导致所谓“炎症级联效应”的发生。主要由Th2细胞产生的IL-4，可抑制单核细胞合成和分泌多种细胞因子，并通过调节TNFα、IL-1β、IL-6的产生来减轻炎症反应[5]。从本研究中各种细胞因子的变化规律可以看出脓毒症时肺组织内促炎症因子与抗炎症因子的表达处于一种失衡状态。这种局部失衡的炎症反应可能是脓毒症并发肺损伤的重要原因。
, 百拇医药
由上述结果可推测临床对脓毒症及其并发的MODS的治疗应根据机体具体的免疫状况及时相采取不同的治疗策略。如果机体的反应以促炎症反应为主，则抗炎症治疗可能有效；而如果是抗炎症反应占主导地位，则应刺激机体的免疫反应。
总之，根据我们的结果促炎症反应与抗炎症反应之间力量对比的失衡可能是脓毒症并发肺损伤的重要原因，调节机体炎症反应维持促炎症细胞因子与抗炎症细胞因子之间的平衡将是值得进一步研究的治疗策略。■
作者简介：吴荣谦，男，1971-12-03生，湖北省武汉市人，汉族，1996年西安医科大学临床医生7年制毕业，军医进修学院96级普通外科博士生，导师孟宪钧教授；发表论文4篇。电话：(010)937164
参考文献：
[1]Baue AE, Durham R, Faist E. Systemic inflammatory response syndrome (SIRS), multiple organ dysfunction syndrome (MODS), multiple organ failure (MOF): are we winning the battle[J]. Shock, 1998,10:79-89.
, http://www.100md.com
[2]Bone RC. Toward a theory regarding the pathogenesis of the systemic inflammatory response syndrome: what we do and do not know about cytokine regulation [J]. Crit Care Med, 1996,24:163-172.
[3]Neugebauer E, Rixen D, Raum M et al. Thirty years of anti-mediator treatment in sepsis and septic shock-what we learned [J]? Langenbecks Arch Surg, 1998,383:26-34.
[4]Bone RC. Immunologic dissonance; a continuing evolution in our understanding of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS) and the multiple organ dysfunction syndrome (MODS) [J]. Ann Intern Med, 1996,125:680-687.
[5]Billiau A, Vandekerckhove F. Cytokines and their interactions with other inflammatory mediators in the pathogenesis of sepsis and septic shock [J]. Eur J Clin Invest, 1991,21:559-573.
收稿日期：1999-05-28
改回日期：1999-07-10, 百拇医药
单位：解放军总医院普外研究所，北京 100853
关键词：细胞因子；脓毒症；肺损伤
军医进修学院学报000105 摘 要：目的：探索促炎症及抗炎症细胞因子在脓毒症肺损伤中的作用。方法：采用RT-PCR的方法比较了脓毒症小鼠肺组织中多种细胞因子(促炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6，抗炎症细胞因子IL-4) mRNA的表达。结果：盲肠结扎穿孔(CLP)后3h TNFα、IL-1β的表达即明显增高，12h 虽有所降低但仍明显高于假手术(sham)组；IL-6 基因在CLP后3h 亦明显增高，至12h 似有进一步增高的趋势；而IL-4 基因在sham组和CLP组中均有表达，各组间无明显差异。结论：促炎症细胞因子与抗炎症细胞因子之间力量对比的失衡可能是脓毒症并发肺损伤的重要原因。
, http://www.100md.com 中图号：R329 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0014-16
The role of pro- and anti-inflammatory cytokine in sepsis induced lung injury
WU Rong-qian, SONG Xu-hua, XU Ying-xin,MENG Xian-jun
(Institute of Surgical Research, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective：To investigate the role of Pro-and Anti-inflammatory cytokine in sepsis induced lung injury. Methods：Sepsis was induced in mice by cecal ligation and puncture (CLP). Sham operation group underwent the same manipulation but without CLP. Pro-inflammatory cytokine (TNFα, IL-1β, IL-6) and Anti-imflammatory cytokine (IL-4) gene expression of lung tissue were assessed by RT-PCR.Results：A significant increase in TNF, IL-1 and IL-6 gene expression was observed at 3 and 12 hours after CLP. The level of TNFα and IL-1β at 3 hours was higher than 12 hours, and the level of IL-6 gene expression at 12 hours was slightly higher than 3 hours. While no difference was seen in IL-4 gene expression between CLP and sham group.Conclusion：The unbalance of pro-and anti-inflammatory cytokine may play a key role in the development of sepsis induced lung injury.
, 百拇医药
Key words：cytokine; sepsis; lung injury▲
脓毒症及常常并发的多器官功能失常综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，救治棘手、死亡率高，一直是外科医生所面对的难题[1]。对其发病机制目前尚不完全清楚，但一般认为细胞因子在其中具有重要的作用[2]。在以往的研究中对典型的促炎症细胞因子如TNFα、IL-1β已有不少报道，认为高水平的TNFα、IL-1β是导致炎症反应过度持久和器官功能受损的重要因素，并依此进行了抗炎症治疗的尝试，但结果发现其无益甚至有害[3]。于是人们开始意识到机体自身抗炎症反应的重要性，提出MODS发生中免疫失衡的观点[4]。作者利用脓毒症小鼠模型，在不同时相同时观察肺组织中促炎症与抗炎症细胞因子在基因水平的表达变化，以探讨MODS发生的基础并寻求可能的防治途径。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 脓毒症模型制作 选用雄性昆明小鼠，体重18～22g，由解放军总医院实验动物中心提供，随机分为两组：盲肠结扎穿孔组(cecal ligation and perforation, 简称CLP组)和假手术组(简称Sham组)，设两个时间点(3和12h)每时间点6只。
1.2 心肺系数及病理形态学观察 开胸取心肺，并称其湿重，计算心肺系数，心肺系数＝肺湿重(g)/心湿重(g)。肉眼观察肺部病变后，常规福尔马林固定、石蜡切片、HE染色。
1.3 细胞因子基因表达检测 采用异硫氰酸胍一步法提取肺组织中的总RNA，紫外分光光度计定量，取1μgRNA在逆转录酶的作用下合成cDNA。以β-actin或β2-MG为内对照基因扩增细胞因子基因。所用引物序列如下：β-actin(内对照基因，478bp)5′AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA3′，5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA3′；β2-MG(内对照基因，300bp)：5′GGCTCGCTCGGTGA-CCCTAGTCTTT3′，5′TCTGCAGGCGTATGT-ATCAGTCTCA3′；TNF-α(349bp)：5′TTCTGTCCCTTTCACTCACTGG3′，5′TTGGTGGT-TTGCTACGACGTGG3′，IL-1β(441bp):5′ATTAGACAGCTGCACTACAGGCTC3′，5′AGATTCCATGGTGAAGTCAATTAT3′；IL-6(156bp):5′TGGAGTCACAGAAGGAGTGGC-TAAG3′，5′TCTGACCACAGTGAGGAATGT-CCAC3′；IL-4(181bp)：5′CGAAGAACACCACAGAGAGTGAGCT3′，5′GACTCATTCATGGTGCAGCTTATCG3′。PCR反应体系为25μl，反应条件：95℃变性5min后，按94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。取PCR反应产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用PBR322/HinfⅠ做分子量标准来判断PCR产物片断大小，EB染色，紫外灯下观察并照相。底片在密度扫描仪上定量，以目的基因扩增量/内对照基因扩增量表示所要检测基因的表达量。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 所有数据均以平均值±标准差(
±s)表示，用t检验进行统计学分析。2 结 果
2.1 肺部病理检查 肉眼检查发现Sham组肺呈淡粉红色，无充血、出血、水肿，CLP后3h小鼠肺部呈暗红色，可见显著的肿胀、充血，至12h更为明显，切面有泡沫状血性液体流出；光镜检查Sham组仅可见轻度充血未见出血现象，而CLP组可见严重的肺水肿和广泛的出血，并有明显的白细胞聚集。
2.2 心肺系数改变 Sham组与CLP组比较，CLP后3h心肺系数即明显增高，至12h虽有进一步增高的趋势但与CLP后3h比较差异无显著性意义(表1)。
表1 各组间心肺系数比较(n=6,
±s), http://www.100md.com
心肺系数
Sham组3h
1.2917±0.0815
CLP组3h
1.4418±0.0522**
Sham组12h
1.3462±0.0967
CLP组12h
1.5186±0.1003*
与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01
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2.3 肺组织细胞因子表达 CLP后3hTNFα、IL-1β基因表达即明显增高，至12h虽有所降低但仍明显高于Sham组，统计学有显著性差异。IL-6基因的表达与TNFα、IL-1β稍有不同：Sham组IL-6有弱表达，CLP后3h明显增高，至12h仍维持在高水平。IL-4基因在Sham组和CLP组中均有表达，各组间差异无显著性意义(表2)。表2 各组间细胞因子mRNA表达比较(n=6,
±s)TNFα
IL-1β
IL-6
IL-4
Sham组3h
0.2918±0.0487
, 百拇医药
0.3188±0.0766
0.4557±0.0980
0.4151±0.0826
CLP组3h
0.7213±0.0875**
0.8573±0.1214**
0.9988±0.2234**
0.4281±0.0763
Sham组12h
0.3003±0.0826
, 百拇医药
0.3330±0.1051
0.4085±0.1059
0.4560±0.0686
CLP组12h
0.6253±0.0717**
0.6732±0.0877**
1.0433±0.1438**
0.4773±0.0970
与Sham组比较，**P<0.01
3 讨 论
, 百拇医药
在脓毒症并发的多器官损伤中，肺脏常常是最多受累的器官。本研究也发现脓毒症时肺脏损伤明显。一般认为它的发生与机体过度的炎症反应密切相关，但对这一炎症反应的规律与机制尚缺乏明确、肯定的认识。由于肺脏是巨噬细胞较为集中的器官，而巨噬细胞是细胞因子的主要来源之一，因此血液中细胞因子的水平很难准确反映肺组织局部的炎症反应程度。本实验用盲肠结扎穿孔(CLP)的方法制做小鼠脓毒症模型，直接观察了脓毒症时肺组织中促炎症与抗炎症细胞因子基因的表达，结果发现脓毒症时肺组织中促炎症细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6的表达均明显增高而抗炎症细胞因子IL-4的表达却无明显改变。TNFα是机体受到有害刺激后最初分泌的细胞因子，它可诱导其它多种因子的产生，如IL-1β可由内毒素直接刺激产生也可由TNFα诱导产生，升高后的IL-1β可与TNFα协同作用共同刺激IL-6的产生。这些促炎症细胞因子之间相互作用可形成许多正反馈环，导致所谓“炎症级联效应”的发生。主要由Th2细胞产生的IL-4，可抑制单核细胞合成和分泌多种细胞因子，并通过调节TNFα、IL-1β、IL-6的产生来减轻炎症反应[5]。从本研究中各种细胞因子的变化规律可以看出脓毒症时肺组织内促炎症因子与抗炎症因子的表达处于一种失衡状态。这种局部失衡的炎症反应可能是脓毒症并发肺损伤的重要原因。
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由上述结果可推测临床对脓毒症及其并发的MODS的治疗应根据机体具体的免疫状况及时相采取不同的治疗策略。如果机体的反应以促炎症反应为主，则抗炎症治疗可能有效；而如果是抗炎症反应占主导地位，则应刺激机体的免疫反应。
总之，根据我们的结果促炎症反应与抗炎症反应之间力量对比的失衡可能是脓毒症并发肺损伤的重要原因，调节机体炎症反应维持促炎症细胞因子与抗炎症细胞因子之间的平衡将是值得进一步研究的治疗策略。■
作者简介：吴荣谦，男，1971-12-03生，湖北省武汉市人，汉族，1996年西安医科大学临床医生7年制毕业，军医进修学院96级普通外科博士生，导师孟宪钧教授；发表论文4篇。电话：(010)937164
参考文献：
[1]Baue AE, Durham R, Faist E. Systemic inflammatory response syndrome (SIRS), multiple organ dysfunction syndrome (MODS), multiple organ failure (MOF): are we winning the battle[J]. Shock, 1998,10:79-89.
, http://www.100md.com
[2]Bone RC. Toward a theory regarding the pathogenesis of the systemic inflammatory response syndrome: what we do and do not know about cytokine regulation [J]. Crit Care Med, 1996,24:163-172.
[3]Neugebauer E, Rixen D, Raum M et al. Thirty years of anti-mediator treatment in sepsis and septic shock-what we learned [J]? Langenbecks Arch Surg, 1998,383:26-34.
[4]Bone RC. Immunologic dissonance; a continuing evolution in our understanding of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS) and the multiple organ dysfunction syndrome (MODS) [J]. Ann Intern Med, 1996,125:680-687.
[5]Billiau A, Vandekerckhove F. Cytokines and their interactions with other inflammatory mediators in the pathogenesis of sepsis and septic shock [J]. Eur J Clin Invest, 1991,21:559-573.
收稿日期：1999-05-28
改回日期：1999-07-10, 百拇医药