透明质酸对胚胎成纤维细胞胶原网架收缩的影响
作者：时安平 罗力生 刘晓军
单位：时安平 罗力生 刘晓军(第一军医大学南方医院整形外科，广州)
关键词：透明质酸；成纤维细胞；胶原
中华医学美容杂志000109 摘 要：目的 探讨羊水中抑制胚胎伤口收缩的成分是否为透明质酸(HA)以及HA对胚胎伤口收缩是否有直接的抑制作用。方法 使用一种体外胚胎伤口收缩模型含成纤维细胞的胶原网架FPCL)，观察HA浓度为1 μg/ml～10 mg/ml时对FPCL收缩的影响。结果 低浓度组(1、5、20、50、100、1 000 μg/ml)的HA对FPCL的收缩指数(CI)与对照组比较，差异无显著意义(P>0.05)；高浓度组(2、6、10 mg/ml)的HA对 FPCL的CI与对照组比较，差异有显著意义(P<0.05)。结论 羊水中抑制胚胎伤口收缩的成分并非为HA，可能胚胎伤口中高浓度的HA与羊水共同参与了胚胎伤口收缩的抑制作用。
, 百拇医药
The effect of hyaluronan on fetal fibroblast populated collagen lattice contraction.
SHI Anping LUO Lisheng LIU Xiaojun
(Department of Plastic Surgery, Nan Fang Hospital of The First Military Medical University, Guangzhou 510515，China)
Abstract：Objective To investigate if the inhibitor of fetal wound contraction in amniotic fluid is hyaluronan and if hyaluronan can inhibit fetal wound contraction directly. Methods An in vitro model of wound contraction containing the fibroblast populated collagen lattice(FPCL) was used in this study to examine the effect of hyaluronan in various concentrations of 1μg/ml～10 mg/ml on contraction of FPCL. Results No significant effect was observed in the presence of low concentrations of hyaluronan(1、5、20、50、100、1000 μg/ml) with the controlled group, while a dramatic effect was observed in the presence of high concentrations of hyaluronan(2、6、10 mg/ml).Conclusion These results showed that the component which inhibit fetal wound contraction in amniotic fluid is not hyaluronan. High concentrations of hyaluronan combined with amniotic fluid might be taken part into the inhibitation of the contraction of fetal wound.
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Key words：Hyaluronan (Hyaluronic acid);Fibroblast;Collagen▲
与成年机体开放性伤口愈合不同，胚胎伤口在愈合过程中不发生伤口收缩，并能获得组织结构完整的无瘢痕愈合[1]。动物体内与体外实验表明，羊水能抑制伤口收缩的发生，但未分离出其抑制性成分[2，3]，虽然羊水及胚胎伤口的透明质酸(HA)含量非常丰富，但羊水中抑制伤口收缩的成分是否为HA以及HA在抑制胚胎伤口收缩中是否发挥作用仍不十分清楚。本实验中我们拟用来源于胎儿皮肤的成纤维细胞与胶原配制成体外胚胎伤口收缩模型含成纤维细胞的胶原网架(fibroblastpopulated collagen lattice, FPCL) ，选择不同浓度的HA，分别观察其对FPCL收缩的影响。
材料和方法
一、材料
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1.细胞:实验细胞的组织来源：胎儿皮肤取自3～5个月引产胎儿。应用组织块法进行成纤维细胞的原代培养：取新鲜皮肤组织，修去皮下组织，在少量小牛血清中剪碎，组织块(0.5～1 mm3)接种于培养瓶中，在饱和湿度的培养箱中培养8～10 h，然后加入含30 %小牛血清的DMEM(Dulbeco＇s Modified Eagles Medium)培养液适量，继续培养，3～4 d换液1次，待细胞长满单层后，用0.25 %胰蛋白酶消化后传代培养，实验用第6～8代细胞。
2.胶原:取胎儿皮肤组织200 g，在无菌条件下修去皮下脂肪，剪成小块，浸泡于0.5 mol/L乙酸中，加入胃蛋白酶，酶量与湿重之比为1∶100，使溶液中酶浓度为 2 mg/ml，持续搅拌23 h，离心，12 000 γ/min，45 min。于上清液中加入胃蛋白酶抑制剂(EDTA乙二胺四乙酸，NEM N乙基马来酰亚胺，PMSF苯*****化物) ,对NaH2PO4充分透析至有沉淀生成，然后离心，条件同上，弃去上清，所得沉淀为Ⅰ、Ⅲ型胶原混合物，将沉淀冻干，称重，溶于1 mmol/L的HCl溶液中，配成5 mg/ml的胶原溶液，4 ℃冰箱中储存备用。
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3.透明质酸(HA):HA为美国Sigma公司产品，从人脐带中提取，分别配成低浓度组(1、5、20、50、100、1 000 μg/ml)及高浓度组(2、6、10 mg/ml)的溶液备用。
二、方法
1.FPCL的制备:将第6～8代指数生长期的细胞用胰酶消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度为2.5×105个细胞/ml，FPCL总体积为2 ml，按下列比例分配：不同浓度的HA或磷酸盐(PBS)缓冲液(对照)占20 %(0.4 ml)，胶原2.5 mg(0.5 ml)，细胞1.25×105个(0.5 ml)，其余为含10 %小牛血清的DMEM液，将4种成分快速混匀，并立即将该混悬液移入直径为35 mm的6孔培养板中(美国Corning公司)，置培养箱中培养。
2.观察指标:①FPCL的收缩情况:分别在FPCL形成6、12、24、36、48、60及72 h用透明坐标纸测定凝胶块的最大与最小直径，计算出两者的代数平均值，按下式计算出凝胶块的收缩指数，用以表示凝胶块的收缩程度：CI=1- (D/D0)2×100 %;CI：收缩指数，D：凝胶块最大与最小直径的均数，D0：初始直径(33 mm)。②FPCL扫描电镜观察:在FPCL收缩稳定后，分别取不同处理组的凝胶块1块，用0.001 mol/L PBS缓冲液冲洗3次，然后置于2.5 %戊二醛中固定24 h，脱水漂洗，树脂固定，喷银，在S450扫描电镜下观察细胞及胶原纤维的排列情况。
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3.统计学分析:差异显著性检验用t检验
结果
一、不同浓度的HA对 FPCL收缩的影响
由图1及表1可见低浓度组的HA对FPCL收缩的抑制作用差异无显著意义(P>0.05)。当HA的浓度超过1 mg/ml时，对FPCL的收缩有明显的抑制作用(P<0.05)，随着浓度的增高，其抑制作用逐渐加强。
图1 不同浓度的HA对FPCL收缩的影响
表1 不同浓度的HA对FPCL收缩的影响(
±s) 组别
, http://www.100md.com PBS(μg/ml)
收缩指数
90±9
t值
P值
1
87±7
1.68
>0.05
5
84±7
1.73
>0.05
, 百拇医药
20
84±7
1.84
>0.05
50
85±6
1.58
>0.05
HA(μg/ml)
100
87±7
1.47
>0.05
, 百拇医药
€1000
80±6
1.36
>0.05
2000
54±6
2.69
<0.05
6000
44±7
3.26
<0.01
10000
, 百拇医药
40±6
3.54
<0.01
二、72 h后 FPCL在电镜下观察情况
FPCL的快速收缩主要发生在前24 h，至 72 h凝胶块已不再收缩，故此时的扫描电镜结果能反映 FPCL的最终收缩状态。HA高浓度组作用后的 FPCL在扫描电镜下可见到HA与胶原纤维聚合成一种网状结构，无明显极性排列，成纤维细胞表面被覆一层光滑的被膜(图 2)；而在羊水组及对照组则无此网状结构，胶原纤维与成纤维细胞呈明显极性排列(图 3)。
图2 HA高浓度组作用后FPCL在扫描电镜下的观察结果，可见
, 百拇医药
HA与胶原纤维聚合成一种网状结构，无明显极性排列×4 000
图3 对照组FPCL在扫描电镜下的观察结果，可见
胶原纤维与成纤维细胞呈明显极性排列×4 000
讨论
大量的研究表明，HA与胚胎无瘢痕愈合有密切关系[1]，但有关HA与胚胎伤口收缩方面的报道不多。基于此，我们根据羊水中HA的含量变化范围0.4～60 μg/ml[4]，设计一组低浓度的HA以对应观察其对FPCL收缩的影响。结果所有低浓度组的HA对FPCL的收缩无明显抑制，从而说明了羊水中的抑制性成分并非为HA，其成分尚有待进一步分析与研究。
, 百拇医药
在本实验中，高浓度组的HA能抑制FPCL的收缩说明HA对伤口收缩的抑制作用与浓度有关。由于FPCL的收缩主要是成纤维细胞与胶原纤维相互作用的一种动态过程，因此，任何影响FPCL收缩的因素都可能从两方面作用于FPCL，一方面是影响了成纤维细胞的功能，另一方面是影响了胶原纤维的构型。我们在扫描电镜下观察到，高浓度的HA与胶原纤维聚合成一种松散的网状结构，胶原纤维未发生明显极性排列与重组，细胞表面也较为光滑，仅有少量胶原纤维粘附。因此我们推测高浓度的HA抑制FPCL的收缩机理，可能是：①HA作为一种润滑剂加快了成纤维细胞在胶原基质中的运动；②高浓度的HA使得较少的胶原纤维粘附于成纤维细胞，进而成纤维细胞对胶原纤维的牵拉收缩作用明显减弱，同时，胶原纤维的粘附减少，也阻碍了成纤维细胞与胶原纤维之间的信息传递，使得成纤维细胞内部的收缩结构也不能得以启动；③HA与胶原纤维聚合成一种网状结构，由于HA是一种有较强吸水性与高度粘滞性的大分子氨基聚糖(GAG)，从而使得这种结构更易保持一种松散、潴水的构型[5]，不利于胶原纤维的收缩与重组排列。
, 百拇医药
从HA对FPCL收缩的影响可以看出，胚胎伤口收缩的抑制不是单一因素作用的结果，其中羊水与高浓度的HA可能分别都发挥了作用。由于体内伤口的环境远较体外复杂，因此，是否还有其它因子参与了这种抑制作用的调控尚待进一步研究。■
参考文献：
[1] Dostal GH, Gamelli RL. Fetal wound healing. Surg Gynecol obstet, 1993,176:299-306.
[2] Haynes JH, Krummel TM, Schateki PF.Histology of the open fetal rabbit wound. Surg Forum, 1987,38:559-560.
[3] Todd MW, Jeffrey SY, Toni Rittenberg. The inhibition of fibroblast populated collagen lattice contraction by human amniotic fluid:a chronologic examination. Plast Reconstr Surg,1993,91:1287-1292.
, http://www.100md.com
[4] Dahl LB, Hopwood JJ, laurent UBG. The Concentration of hyaluronate in amniotic fluid. Biochem Med, 1983,30:280-282.
[5] Mast BA, Haynes JH, Krummel TM. In vivo degradation of fetal wound hyaluronic acid results in increased fibroblasia, Collagen deposition, and neovascularization, Plast Reconstr Surg,1992,89:503-509.
收稿日期：1998-10-27, http://www.100md.com
单位：时安平 罗力生 刘晓军(第一军医大学南方医院整形外科，广州)
关键词：透明质酸；成纤维细胞；胶原
中华医学美容杂志000109 摘 要：目的 探讨羊水中抑制胚胎伤口收缩的成分是否为透明质酸(HA)以及HA对胚胎伤口收缩是否有直接的抑制作用。方法 使用一种体外胚胎伤口收缩模型含成纤维细胞的胶原网架FPCL)，观察HA浓度为1 μg/ml～10 mg/ml时对FPCL收缩的影响。结果 低浓度组(1、5、20、50、100、1 000 μg/ml)的HA对FPCL的收缩指数(CI)与对照组比较，差异无显著意义(P>0.05)；高浓度组(2、6、10 mg/ml)的HA对 FPCL的CI与对照组比较，差异有显著意义(P<0.05)。结论 羊水中抑制胚胎伤口收缩的成分并非为HA，可能胚胎伤口中高浓度的HA与羊水共同参与了胚胎伤口收缩的抑制作用。
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The effect of hyaluronan on fetal fibroblast populated collagen lattice contraction.
SHI Anping LUO Lisheng LIU Xiaojun
(Department of Plastic Surgery, Nan Fang Hospital of The First Military Medical University, Guangzhou 510515，China)
Abstract：Objective To investigate if the inhibitor of fetal wound contraction in amniotic fluid is hyaluronan and if hyaluronan can inhibit fetal wound contraction directly. Methods An in vitro model of wound contraction containing the fibroblast populated collagen lattice(FPCL) was used in this study to examine the effect of hyaluronan in various concentrations of 1μg/ml～10 mg/ml on contraction of FPCL. Results No significant effect was observed in the presence of low concentrations of hyaluronan(1、5、20、50、100、1000 μg/ml) with the controlled group, while a dramatic effect was observed in the presence of high concentrations of hyaluronan(2、6、10 mg/ml).Conclusion These results showed that the component which inhibit fetal wound contraction in amniotic fluid is not hyaluronan. High concentrations of hyaluronan combined with amniotic fluid might be taken part into the inhibitation of the contraction of fetal wound.
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Key words：Hyaluronan (Hyaluronic acid);Fibroblast;Collagen▲
与成年机体开放性伤口愈合不同，胚胎伤口在愈合过程中不发生伤口收缩，并能获得组织结构完整的无瘢痕愈合[1]。动物体内与体外实验表明，羊水能抑制伤口收缩的发生，但未分离出其抑制性成分[2，3]，虽然羊水及胚胎伤口的透明质酸(HA)含量非常丰富，但羊水中抑制伤口收缩的成分是否为HA以及HA在抑制胚胎伤口收缩中是否发挥作用仍不十分清楚。本实验中我们拟用来源于胎儿皮肤的成纤维细胞与胶原配制成体外胚胎伤口收缩模型含成纤维细胞的胶原网架(fibroblastpopulated collagen lattice, FPCL) ，选择不同浓度的HA，分别观察其对FPCL收缩的影响。
材料和方法
一、材料
, http://www.100md.com
1.细胞:实验细胞的组织来源：胎儿皮肤取自3～5个月引产胎儿。应用组织块法进行成纤维细胞的原代培养：取新鲜皮肤组织，修去皮下组织，在少量小牛血清中剪碎，组织块(0.5～1 mm3)接种于培养瓶中，在饱和湿度的培养箱中培养8～10 h，然后加入含30 %小牛血清的DMEM(Dulbeco＇s Modified Eagles Medium)培养液适量，继续培养，3～4 d换液1次，待细胞长满单层后，用0.25 %胰蛋白酶消化后传代培养，实验用第6～8代细胞。
2.胶原:取胎儿皮肤组织200 g，在无菌条件下修去皮下脂肪，剪成小块，浸泡于0.5 mol/L乙酸中，加入胃蛋白酶，酶量与湿重之比为1∶100，使溶液中酶浓度为 2 mg/ml，持续搅拌23 h，离心，12 000 γ/min，45 min。于上清液中加入胃蛋白酶抑制剂(EDTA乙二胺四乙酸，NEM N乙基马来酰亚胺，PMSF苯*****化物) ,对NaH2PO4充分透析至有沉淀生成，然后离心，条件同上，弃去上清，所得沉淀为Ⅰ、Ⅲ型胶原混合物，将沉淀冻干，称重，溶于1 mmol/L的HCl溶液中，配成5 mg/ml的胶原溶液，4 ℃冰箱中储存备用。
, http://www.100md.com
3.透明质酸(HA):HA为美国Sigma公司产品，从人脐带中提取，分别配成低浓度组(1、5、20、50、100、1 000 μg/ml)及高浓度组(2、6、10 mg/ml)的溶液备用。
二、方法
1.FPCL的制备:将第6～8代指数生长期的细胞用胰酶消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度为2.5×105个细胞/ml，FPCL总体积为2 ml，按下列比例分配：不同浓度的HA或磷酸盐(PBS)缓冲液(对照)占20 %(0.4 ml)，胶原2.5 mg(0.5 ml)，细胞1.25×105个(0.5 ml)，其余为含10 %小牛血清的DMEM液，将4种成分快速混匀，并立即将该混悬液移入直径为35 mm的6孔培养板中(美国Corning公司)，置培养箱中培养。
2.观察指标:①FPCL的收缩情况:分别在FPCL形成6、12、24、36、48、60及72 h用透明坐标纸测定凝胶块的最大与最小直径，计算出两者的代数平均值，按下式计算出凝胶块的收缩指数，用以表示凝胶块的收缩程度：CI=1- (D/D0)2×100 %;CI：收缩指数，D：凝胶块最大与最小直径的均数，D0：初始直径(33 mm)。②FPCL扫描电镜观察:在FPCL收缩稳定后，分别取不同处理组的凝胶块1块，用0.001 mol/L PBS缓冲液冲洗3次，然后置于2.5 %戊二醛中固定24 h，脱水漂洗，树脂固定，喷银，在S450扫描电镜下观察细胞及胶原纤维的排列情况。
, http://www.100md.com
3.统计学分析:差异显著性检验用t检验
结果
一、不同浓度的HA对 FPCL收缩的影响
由图1及表1可见低浓度组的HA对FPCL收缩的抑制作用差异无显著意义(P>0.05)。当HA的浓度超过1 mg/ml时，对FPCL的收缩有明显的抑制作用(P<0.05)，随着浓度的增高，其抑制作用逐渐加强。
图1 不同浓度的HA对FPCL收缩的影响
表1 不同浓度的HA对FPCL收缩的影响(
±s) 组别, http://www.100md.com PBS(μg/ml)
收缩指数
90±9
t值
P值
1
87±7
1.68
>0.05
5
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1.73
>0.05
, 百拇医药
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84±7
1.84
>0.05
50
85±6
1.58
>0.05
HA(μg/ml)
100
87±7
1.47
>0.05
, 百拇医药
€1000
80±6
1.36
>0.05
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40±6
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二、72 h后 FPCL在电镜下观察情况
FPCL的快速收缩主要发生在前24 h，至 72 h凝胶块已不再收缩，故此时的扫描电镜结果能反映 FPCL的最终收缩状态。HA高浓度组作用后的 FPCL在扫描电镜下可见到HA与胶原纤维聚合成一种网状结构，无明显极性排列，成纤维细胞表面被覆一层光滑的被膜(图 2)；而在羊水组及对照组则无此网状结构，胶原纤维与成纤维细胞呈明显极性排列(图 3)。
图2 HA高浓度组作用后FPCL在扫描电镜下的观察结果，可见
, 百拇医药
HA与胶原纤维聚合成一种网状结构，无明显极性排列×4 000
图3 对照组FPCL在扫描电镜下的观察结果，可见
胶原纤维与成纤维细胞呈明显极性排列×4 000
讨论
大量的研究表明，HA与胚胎无瘢痕愈合有密切关系[1]，但有关HA与胚胎伤口收缩方面的报道不多。基于此，我们根据羊水中HA的含量变化范围0.4～60 μg/ml[4]，设计一组低浓度的HA以对应观察其对FPCL收缩的影响。结果所有低浓度组的HA对FPCL的收缩无明显抑制，从而说明了羊水中的抑制性成分并非为HA，其成分尚有待进一步分析与研究。
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在本实验中，高浓度组的HA能抑制FPCL的收缩说明HA对伤口收缩的抑制作用与浓度有关。由于FPCL的收缩主要是成纤维细胞与胶原纤维相互作用的一种动态过程，因此，任何影响FPCL收缩的因素都可能从两方面作用于FPCL，一方面是影响了成纤维细胞的功能，另一方面是影响了胶原纤维的构型。我们在扫描电镜下观察到，高浓度的HA与胶原纤维聚合成一种松散的网状结构，胶原纤维未发生明显极性排列与重组，细胞表面也较为光滑，仅有少量胶原纤维粘附。因此我们推测高浓度的HA抑制FPCL的收缩机理，可能是：①HA作为一种润滑剂加快了成纤维细胞在胶原基质中的运动；②高浓度的HA使得较少的胶原纤维粘附于成纤维细胞，进而成纤维细胞对胶原纤维的牵拉收缩作用明显减弱，同时，胶原纤维的粘附减少，也阻碍了成纤维细胞与胶原纤维之间的信息传递，使得成纤维细胞内部的收缩结构也不能得以启动；③HA与胶原纤维聚合成一种网状结构，由于HA是一种有较强吸水性与高度粘滞性的大分子氨基聚糖(GAG)，从而使得这种结构更易保持一种松散、潴水的构型[5]，不利于胶原纤维的收缩与重组排列。
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从HA对FPCL收缩的影响可以看出，胚胎伤口收缩的抑制不是单一因素作用的结果，其中羊水与高浓度的HA可能分别都发挥了作用。由于体内伤口的环境远较体外复杂，因此，是否还有其它因子参与了这种抑制作用的调控尚待进一步研究。■
参考文献：
[1] Dostal GH, Gamelli RL. Fetal wound healing. Surg Gynecol obstet, 1993,176:299-306.
[2] Haynes JH, Krummel TM, Schateki PF.Histology of the open fetal rabbit wound. Surg Forum, 1987,38:559-560.
[3] Todd MW, Jeffrey SY, Toni Rittenberg. The inhibition of fibroblast populated collagen lattice contraction by human amniotic fluid:a chronologic examination. Plast Reconstr Surg,1993,91:1287-1292.
, http://www.100md.com
[4] Dahl LB, Hopwood JJ, laurent UBG. The Concentration of hyaluronate in amniotic fluid. Biochem Med, 1983,30:280-282.
[5] Mast BA, Haynes JH, Krummel TM. In vivo degradation of fetal wound hyaluronic acid results in increased fibroblasia, Collagen deposition, and neovascularization, Plast Reconstr Surg,1992,89:503-509.
收稿日期：1998-10-27, http://www.100md.com