川白芷离体培养与多倍体诱导过程中的形态组织学观察
作者：彭菲 郭昱
单位：彭菲(湖南中医学院 药学分院，湖南 长沙 410004)；郭昱(湖南中医学院 药学分院，湖南 长沙 410004)
关键词：川白芷；离体培养；多倍体诱导；形态学；组织学
中国中药杂志000106 摘 要：目的：探索川白芷离体培养过程中的形态变化与组织发生的关系，为其多倍体诱变寻找最佳处理时期。方法：对离体培养的外植体采取不定期取材固定，作切片观察；当其分化出不定芽时，用秋水仙液作诱变处理。结果：不定芽主要为外起源，最适宜作诱变处理；培养38 d左右为诱变的最佳处理期；此种处理方法证明是有效的。结论：对组织培养中产生的不定芽作诱变处理，是一种行之有效的生物技术方法。
Observation on Morphology and Histology of Angelica dahurica
, http://www.100md.com
(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et
Yuan in the Process of in Vitro Cultivation
and Polyploid Induction
PENG Fei，GUO Yu
(Hunan College of Traditional Chinese Medicine,Hunan Changsha 410004，China)
Abstract：Objective:To explore the relationship between morphogenesis and histogenesis in the process of in vitro cultivation of Angelica dahurica f.var.formosana,and determine the best period for its polyploid induction.Method:In the different periods of in vitro cultivation,the explants were obtained and their sections observed.When the adventitiousbuds began to differenciate,aqueous solution was applied for polyploid induction.Result:The adventitious buds were mainly externally originated and thus fit for polyploid induction.The most appropriate period for induction was around the 38th day of cultivation.Conclusion:Induction treatment can be used as an effective biotechnological approach to adventitious buds in the process of tissue cultivation.
, 百拇医药
Key words：Angelica dahurica f.var.formosana；in vitro culture;polyploid induction;morphology;histo-logy▲
川白芷为伞形科植物，其根具有祛风燥湿、消肿止痛功效，是常用中药。为了解决白芷生产中存在的问题，我们拟采用生物技术培育白芷优良品种，有关川白芷的试管苗再生，我们已进行了研究和报道[1]。为了更深入地了解培养过程中的形态变化与组织发生的关系，为诱变寻找最佳处理时期提供理论依据，特进行了离体培养组织学观察，同时，对多倍体诱导所发生的变化也进行了比较研究。
1 材料和方法
1.1 供试种：川白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hood.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan来源于湖南省著名白芷产区茶陵县，经作者鉴定。
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1.2 方法
1.2.1 离体培养：培养方法按文献[1]。外植体取叶轴切段，培养4 d后开始第1次取材固定，所用固定液为F A A，以后的取材时期以外植体在外观上有变化为准。常规石蜡切片法制片，切片厚12 μm，以铁矾-苏木精染色，显微观察并摄影。
1.2.2 多倍体诱导：在离体培养中，当叶轴外植体上刚刚开始出现不定芽的分化时，立即用一定浓度的无菌秋水仙液处理一定时间，然后用无菌水反复冲洗，转入新的培养基中继续培养，经培养一定时间后，不定芽长大。另设对照组，用无菌水代替秋水仙液做相同时间的处理，然后对比生长变化情况。
2 结果
接种4 d后，叶轴切段开始增粗，切口端膨胀并多处开裂。显微观察发现各维管束韧皮部细胞核大质浓，有先行启动迹象。10 d后，外植体进一步增粗，并在切口处出现少量愈伤组织。切片中看到形成层与整个维管束鞘也开始启动(图1中1)，且组织内部出现许多分生中心(图1中2)，由此开始了快速的细胞增殖过程。同时发现，表皮细胞及其下层细胞也明显出现分裂现象(图1中4)，这是为了适应外植体内部的增粗而产生的。19 d后，两切口愈伤组织更加明显(图1中6)，显微观察，其内部存在有单向极性分生中心(图1中3)，它向一侧不断分裂产生大量愈伤组织细胞。38 d后，外植体上绿色突起明显，开始出现芽的分化。切片中发现，芽的起源多为外起源，它是由近表皮的分生中心单向极性进行旺盛的细胞分裂(图1中5)，分生细胞增加并向外形成愈伤组织，再进一步分化为芽原基(图1中8)。
, 百拇医药
图1 川白芷离体培养与多倍体诱导的观察
1～5,8，9.叶轴 1,3,4,5,9.(×260) 2.(×400) 8.(×26) 6,7.叶轴外观(×2) 10.小叶片外观
11.独立试管小苗(×2) 12.处理叶的下表皮 13.正常叶的下表皮(×400) 14.正常试管染色体(×530)
15.处理试管苗染色体(×530) 6，7，10，11.为肉眼观察，其余均为显微观察
此外，也有不少外植体块增大，肿胀状，某些部位有不规则突起，但无明显的愈伤组织出现。切片发现，组织内部分生细胞随处可见，但外方表皮围住，始终未突破。如果某一侧持续向外分生细胞，突起越来越明显，最终从外观看似分化出绿芽，但切片发现此“芽”无组织分化(图1中9)，当其伸长至1 cm左右时，便停止生长。还有某些叶轴外植体在切口端形成少量致密的愈伤组织后，开始在其上形成一种外观为“球状体”的结构(图1中7)，但3个月来始终未见有芽的分化。为此，对其采取了表面划痕、再次切割接种的办法，结果8 d后分化出了丛生芽。
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用秋水仙液处理早期不定芽后，经过一段时间的生长与观察，发现被处理者(简称B)与对照者(简称C)在外观上出现了明显的差异。对此，又进行了部分显微观察和鉴定(见表1)。
以上外观和显微特征均显示经秋水仙液处理的不定芽所形成的小苗已有了多倍体的一些特征。我们将其从基部切下，转入生根培养基中，经过近1个月的培养，终于在其基部生出了少量纤细的小根，取根尖进行常规染色体镜检，镜检细胞数为20个，结果如下：对照C，2n=22(图1中14)，与文献记载相符[2]；处理B，仅发现有4个细胞中为2n=22，其余16个细胞均为2n=44(图1中15)，证明细胞中染色体数目发生了诱变(诱变率约80%)，但遗憾的是生根量太少，小苗始终未能独立成活。
表1 不定芽受秋水仙液处理后的变化 观察材料
小苗发育
叶片性状
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叶下表皮
生根
对照C
发育正常
较薄，叶面平整，绿色，有一定韧性(附图1中10左)
易撕取。气孔和保卫细胞均小些，保卫细胞中所含叶绿体了少些(图1中13)
易于生根，已移栽成活
处理B
丛生矮化，长得慢，部分有水浸状
明显加厚，叶色深绿，叶面皱折，显粗糙，脉纹也加深，叶脆，易折断(图1中10右)
, 百拇医药 很难撕取。气孔和保卫细胞相对较大，保卫细胞中所含叶绿体明显多于对照组(图1中12)
生根量少，未能独立存活
3 小结与讨论
从切片观察可以看出，叶轴外植体在接种后10 d左右时，内部出现较多的变化，多个部位开始启动。同时，分生细胞的分裂速度开始加快，说明这一时期是叶轴外植体的敏感期，应加强对培养条件的控制；芽原基的产生主要为外起源，而外起源的芽从理论上来说比内起源的芽更适宜于作诱变处理；从时间上来看，培养38 d时，早期不定芽已开始分化出来，此时应为诱变的最佳处理期。本试验初步证明了这一点。
在培养中，不仅出现了前述的“球状体”，也出现了较多类似“球状体”的组织块，只是其表面不象前者那显得光滑。让其自然分化出芽需较长时间，且有一些长期不分化，组织块逐渐变褐色，走向衰老。当我们采取了分割和表面划痕的方法时，发现很快就有丛生芽从组织块切割处分化出来。这就为加速不定芽的分化，提高分化率提供了一种有效的处理手段。
, 百拇医药
前已提到，如果外植体一侧持续向外分生细胞，必将出现明显突起，而成为伸长的“叶状体”组织(图1中9)，这种现象在桂耀林等[3]关于罗汉果叶组织培养中曾有过记载，但记载中的叶状体内部有维管束贯穿，并且叶状体不久就又开始分化芽原基而产生不定芽。而“叶状体”切片中却没有发现维管束，它也不再分化不定芽，长到一定程度便不再发育了。由于它的外观很象绿芽，所以我们称之为“假芽”，它的产生实质上就是组织块的极性增殖现象。
培养中还发现，外植体某些部位上先生出相对较粗较直的单根，紧接着生出2片小叶，进一步发育出4～5片叶，然后便自动脱离开母体，成为独立的试管小苗(图1中11)。这一现象很象胚状体的特征，但在培养的连续切片中，我们始终没有看到胚状体的出现，并且，当它长到2～3 cm长时，便不再长大了。横切开根部，发现它的白色粉性与生药白芷极为相似。象这样的试管小苗，已出现了10几株，但有关它的来历和发育过程，如何促使其继续生长，仍需进一步研究。
基金项目：湖南省科委重点资助课题(97SSY1005)
参考文献：
[1]彭 菲，王凤翱.川白芷试管苗再生的研究.中草药，1997，28(6)：364
[2]潘泽惠，秦慧贞，吴竹君，等.白芷的核型研究及其分类意义.植物分类学报，1985，23(3)：185
[3]桂耀林,顾淑荣,徐廷玉,等.罗汉果叶组织培养中的器官发生.植物学报,1984，26(2)：120
收稿日期：1999-03-17, 百拇医药
单位：彭菲(湖南中医学院 药学分院，湖南 长沙 410004)；郭昱(湖南中医学院 药学分院，湖南 长沙 410004)
关键词：川白芷；离体培养；多倍体诱导；形态学；组织学
中国中药杂志000106 摘 要：目的：探索川白芷离体培养过程中的形态变化与组织发生的关系，为其多倍体诱变寻找最佳处理时期。方法：对离体培养的外植体采取不定期取材固定，作切片观察；当其分化出不定芽时，用秋水仙液作诱变处理。结果：不定芽主要为外起源，最适宜作诱变处理；培养38 d左右为诱变的最佳处理期；此种处理方法证明是有效的。结论：对组织培养中产生的不定芽作诱变处理，是一种行之有效的生物技术方法。
Observation on Morphology and Histology of Angelica dahurica
, http://www.100md.com
(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et
Yuan in the Process of in Vitro Cultivation
and Polyploid Induction
PENG Fei，GUO Yu
(Hunan College of Traditional Chinese Medicine,Hunan Changsha 410004，China)
Abstract：Objective:To explore the relationship between morphogenesis and histogenesis in the process of in vitro cultivation of Angelica dahurica f.var.formosana,and determine the best period for its polyploid induction.Method:In the different periods of in vitro cultivation,the explants were obtained and their sections observed.When the adventitiousbuds began to differenciate,aqueous solution was applied for polyploid induction.Result:The adventitious buds were mainly externally originated and thus fit for polyploid induction.The most appropriate period for induction was around the 38th day of cultivation.Conclusion:Induction treatment can be used as an effective biotechnological approach to adventitious buds in the process of tissue cultivation.
, 百拇医药
Key words：Angelica dahurica f.var.formosana；in vitro culture;polyploid induction;morphology;histo-logy▲
川白芷为伞形科植物，其根具有祛风燥湿、消肿止痛功效，是常用中药。为了解决白芷生产中存在的问题，我们拟采用生物技术培育白芷优良品种，有关川白芷的试管苗再生，我们已进行了研究和报道[1]。为了更深入地了解培养过程中的形态变化与组织发生的关系，为诱变寻找最佳处理时期提供理论依据，特进行了离体培养组织学观察，同时，对多倍体诱导所发生的变化也进行了比较研究。
1 材料和方法
1.1 供试种：川白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hood.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan来源于湖南省著名白芷产区茶陵县，经作者鉴定。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 离体培养：培养方法按文献[1]。外植体取叶轴切段，培养4 d后开始第1次取材固定，所用固定液为F A A，以后的取材时期以外植体在外观上有变化为准。常规石蜡切片法制片，切片厚12 μm，以铁矾-苏木精染色，显微观察并摄影。
1.2.2 多倍体诱导：在离体培养中，当叶轴外植体上刚刚开始出现不定芽的分化时，立即用一定浓度的无菌秋水仙液处理一定时间，然后用无菌水反复冲洗，转入新的培养基中继续培养，经培养一定时间后，不定芽长大。另设对照组，用无菌水代替秋水仙液做相同时间的处理，然后对比生长变化情况。
2 结果
接种4 d后，叶轴切段开始增粗，切口端膨胀并多处开裂。显微观察发现各维管束韧皮部细胞核大质浓，有先行启动迹象。10 d后，外植体进一步增粗，并在切口处出现少量愈伤组织。切片中看到形成层与整个维管束鞘也开始启动(图1中1)，且组织内部出现许多分生中心(图1中2)，由此开始了快速的细胞增殖过程。同时发现，表皮细胞及其下层细胞也明显出现分裂现象(图1中4)，这是为了适应外植体内部的增粗而产生的。19 d后，两切口愈伤组织更加明显(图1中6)，显微观察，其内部存在有单向极性分生中心(图1中3)，它向一侧不断分裂产生大量愈伤组织细胞。38 d后，外植体上绿色突起明显，开始出现芽的分化。切片中发现，芽的起源多为外起源，它是由近表皮的分生中心单向极性进行旺盛的细胞分裂(图1中5)，分生细胞增加并向外形成愈伤组织，再进一步分化为芽原基(图1中8)。
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图1 川白芷离体培养与多倍体诱导的观察
1～5,8，9.叶轴 1,3,4,5,9.(×260) 2.(×400) 8.(×26) 6,7.叶轴外观(×2) 10.小叶片外观
11.独立试管小苗(×2) 12.处理叶的下表皮 13.正常叶的下表皮(×400) 14.正常试管染色体(×530)
15.处理试管苗染色体(×530) 6，7，10，11.为肉眼观察，其余均为显微观察
此外，也有不少外植体块增大，肿胀状，某些部位有不规则突起，但无明显的愈伤组织出现。切片发现，组织内部分生细胞随处可见，但外方表皮围住，始终未突破。如果某一侧持续向外分生细胞，突起越来越明显，最终从外观看似分化出绿芽，但切片发现此“芽”无组织分化(图1中9)，当其伸长至1 cm左右时，便停止生长。还有某些叶轴外植体在切口端形成少量致密的愈伤组织后，开始在其上形成一种外观为“球状体”的结构(图1中7)，但3个月来始终未见有芽的分化。为此，对其采取了表面划痕、再次切割接种的办法，结果8 d后分化出了丛生芽。
, http://www.100md.com
用秋水仙液处理早期不定芽后，经过一段时间的生长与观察，发现被处理者(简称B)与对照者(简称C)在外观上出现了明显的差异。对此，又进行了部分显微观察和鉴定(见表1)。
以上外观和显微特征均显示经秋水仙液处理的不定芽所形成的小苗已有了多倍体的一些特征。我们将其从基部切下，转入生根培养基中，经过近1个月的培养，终于在其基部生出了少量纤细的小根，取根尖进行常规染色体镜检，镜检细胞数为20个，结果如下：对照C，2n=22(图1中14)，与文献记载相符[2]；处理B，仅发现有4个细胞中为2n=22，其余16个细胞均为2n=44(图1中15)，证明细胞中染色体数目发生了诱变(诱变率约80%)，但遗憾的是生根量太少，小苗始终未能独立成活。
表1 不定芽受秋水仙液处理后的变化 观察材料
小苗发育
叶片性状
, http://www.100md.com
叶下表皮
生根
对照C
发育正常
较薄，叶面平整，绿色，有一定韧性(附图1中10左)
易撕取。气孔和保卫细胞均小些，保卫细胞中所含叶绿体了少些(图1中13)
易于生根，已移栽成活
处理B
丛生矮化，长得慢，部分有水浸状
明显加厚，叶色深绿，叶面皱折，显粗糙，脉纹也加深，叶脆，易折断(图1中10右)
, 百拇医药 很难撕取。气孔和保卫细胞相对较大，保卫细胞中所含叶绿体明显多于对照组(图1中12)
生根量少，未能独立存活
3 小结与讨论
从切片观察可以看出，叶轴外植体在接种后10 d左右时，内部出现较多的变化，多个部位开始启动。同时，分生细胞的分裂速度开始加快，说明这一时期是叶轴外植体的敏感期，应加强对培养条件的控制；芽原基的产生主要为外起源，而外起源的芽从理论上来说比内起源的芽更适宜于作诱变处理；从时间上来看，培养38 d时，早期不定芽已开始分化出来，此时应为诱变的最佳处理期。本试验初步证明了这一点。
在培养中，不仅出现了前述的“球状体”，也出现了较多类似“球状体”的组织块，只是其表面不象前者那显得光滑。让其自然分化出芽需较长时间，且有一些长期不分化，组织块逐渐变褐色，走向衰老。当我们采取了分割和表面划痕的方法时，发现很快就有丛生芽从组织块切割处分化出来。这就为加速不定芽的分化，提高分化率提供了一种有效的处理手段。
, 百拇医药
前已提到，如果外植体一侧持续向外分生细胞，必将出现明显突起，而成为伸长的“叶状体”组织(图1中9)，这种现象在桂耀林等[3]关于罗汉果叶组织培养中曾有过记载，但记载中的叶状体内部有维管束贯穿，并且叶状体不久就又开始分化芽原基而产生不定芽。而“叶状体”切片中却没有发现维管束，它也不再分化不定芽，长到一定程度便不再发育了。由于它的外观很象绿芽，所以我们称之为“假芽”，它的产生实质上就是组织块的极性增殖现象。
培养中还发现，外植体某些部位上先生出相对较粗较直的单根，紧接着生出2片小叶，进一步发育出4～5片叶，然后便自动脱离开母体，成为独立的试管小苗(图1中11)。这一现象很象胚状体的特征，但在培养的连续切片中，我们始终没有看到胚状体的出现，并且，当它长到2～3 cm长时，便不再长大了。横切开根部，发现它的白色粉性与生药白芷极为相似。象这样的试管小苗，已出现了10几株，但有关它的来历和发育过程，如何促使其继续生长，仍需进一步研究。
基金项目：湖南省科委重点资助课题(97SSY1005)
参考文献：
[1]彭 菲，王凤翱.川白芷试管苗再生的研究.中草药，1997，28(6)：364
[2]潘泽惠，秦慧贞，吴竹君，等.白芷的核型研究及其分类意义.植物分类学报，1985，23(3)：185
[3]桂耀林,顾淑荣,徐廷玉,等.罗汉果叶组织培养中的器官发生.植物学报,1984，26(2)：120
收稿日期：1999-03-17, 百拇医药