腹膜透析对腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响
作者：李继承 张凯 杨泽然
单位：李继承(国家自然科学基金资助项目 NO.39970381)；杨泽然(浙江大学医学院淋巴学研究室 杭州，310006)；张凯(杭州红十字会医院肾内科)
关键词：腹膜透析；一氧化氮；腹膜淋巴孔
肾脏病与透析肾移植杂志000104 摘 要 目的：研究腹膜透析(PD)对巨噬细胞产生一氧化氮(nitric oxide，NO)和腹膜淋巴孔的影响，探讨PD失超滤机制。 方法：①应用Baxter腹透液建立PD小鼠模型；②用全自动酶标仪动态测定NO量；③用扫描电镜观察不同时间点腹膜间皮超微病理变化；④使用计算机与扫描电镜联机的图像处理系统，测定不同PD时间点腹膜淋巴孔的改变。 结果：随着PD进行，大量巨噬细胞经腹膜淋巴孔游出，进入腹腔形成乳斑。NO浓度逐渐增高，间皮细胞损伤趋严重，腹膜淋巴孔孔径增大、分布密度增高。停止PD，乳斑减少，NO量逐渐降低，损伤的间皮细胞开始修复，腹膜淋巴孔渐趋正常。至停止PD 40天，间皮细胞基本修复，腹膜淋巴孔恢复正常。 结论：PD使大量巨噬细胞进入腹腔，巨噬细胞产生的高浓度NO可损害间皮细胞、舒张腹膜淋巴孔，可能与腹透液吸收增加，PD失超滤有关。
, 百拇医药
EFFECTS OF PERITONEAL DIALYSIS ON MACROPHAGE NITRIC OXIDE PRODUCTION AND ITS RELATION WITH PERITONEAL LYMPHATIC STOMATA
LI Jicheng YANG Zerang
(Department of Lymphology，Zhejiang University Medical College，Hangzhou，310031)
ZHANG Kai
(Hangzhou Red-Cross Hospital)
OBJECTIVE Long-term peritoneal dialysis inevitably leads to ultrafiltration failure.An animal model was established to study the mechanism of ultrafiltration failure in peritoneal dialysis by analyzing nitric oxide(NO) regulation of peritoneal lymphatics stomata and lymph reabsorption form the peritoneal cavity. METHODOLOGY ①The animal model of peritoneal dialysis was established with the application of Baxter dialysate； ②Dynamic NO measurements were performed during peritoneal dialysis and its cessation； ③Sequential observation of ultra-structural changes in peritoneal mesothelium was made under scanning electron microscope(SEM)at different length of dialysis time； ④Dynamic changes in the peritoneal lymphatic stomata were studied by computer image processing system. RESULTS Numerous macrophages were found to enter peritoneal cavity to form milky spot.Damages of mesothelial cells，increased density of their distribution and enlargement of the peritoneal lymphatic stomata were found to be associated with the increase in macrophage NO quantity during the experiment.The mesothelium damage amelioration and the peritoneal lymphatic stomata recovery were observed with the decreasing NO quantity in peritoneal dialysate.Complete recovery of mesothelium and the peritoneal lymphatic stomata were observed in this model in 40 days after the cessation of peritoneal dialysis. CONCLUSION In long-term peritoneal dialysis，increased peritoneal macrophages is associated with increased NO production，which might damage mesothelium and relax lymphatic stomata leading to the enhanced lymph absorption or ultrafiltration failure.
, 百拇医药
Key words peritoneal dialysis nitric oxide ultrafiltration
腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)作为一种肾脏替代疗法，对改善慢性肾衰患者的临床症状和延长生命起了重要作用。随着PD疗效的逐渐提高，PD患者生存率也逐年提高，长期PD患者增多。然而，随着PD时间的延长，将不可避免地产生失超滤(ultrafiltration failure)，严重降低了PD效能，已成为长期PD患者常见难题。
在临床上，影响PD超滤的主要因素有：①腹透液的糖浓度；②腹膜转运能力；③腹膜淋巴孔的持续吸收作用。对于常规使用的低糖浓度腹透液和特定的PD患者，前两者是恒定的。所以，腹腔淋巴吸收作用是导致PD失超滤的直接因素[1]。通常认为，腹腔淋巴引流是持续的，其速度为1～1.5 ml/min[2]，但是，难以解释随着PD时间延长出现的严重失超滤现象。作者以往的研究认为，长期PD产生炎性粘连，牵拉腹膜淋巴孔，使淋巴孔分布密度和孔径均增大，引起PD后期淋巴重吸收大幅度增加，导致失超滤[3]。虽然，规范化的操作和良好的PD环境，腹膜炎产生的机会甚少，但腹腔淋巴重吸收，随PD延长依然大量增加，因此失超滤同样不可避免。PD时，腹腔淋巴重吸收的调控机制迄今尚无报道。本文旨在通过PD动物模型，研究PD对腹腔巨噬细胞产生NO对腹膜淋巴孔的影响和腹膜间皮超微病理变化，探讨长期PD失超滤的机制。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物 取健康雄性NIH小鼠102只(浙江大学医学院实验动物中心提供)，体重25.5～36.4g。随机分为3组，即腹透液组(n＝36)，生理盐水组(n＝36)和正常对照组(n＝30)。
1.2 腹透液 Baxter腹透液(广州百特药物有限公司产品)，含1.5%葡萄糖的乳酸盐，渗透压346 Osmmol/L，pH 5.2，Ca2+ 3.5 mmol/L，Mg2+0.5 mmol/L，Na+132 mmol/L，Cl-96 mmol/L，HCO-3 40 mmol/L。
1.3 PD动物模型[4] 将腹透液和生理盐水分别注入各组小鼠腹腔，1ml/次，2次/d，间隔8h。在PD的第10、20、40天和停止透析的第10、20、40天取腹膜巨噬细胞测NO产量，取膈腹膜作扫描电镜观察腹膜淋巴孔并进行计算机图像处理。
, 百拇医药
1.4 巨噬细胞诱生处理和NO检测
1.4.1 小鼠处死前4天腹腔注射3%硫乙醇酸盐。收集腹腔巨噬细胞，以D-Hanks液洗涤2次，调细胞浓度至1×109/L，培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，加入96孔板，200 μl/孔，置37℃，5%CO2孵箱中，2h后洗去非贴附细胞，重新加入等量培养液，培养24h后，取上清液，测NO量。
1.4.2 按文献[5]方法，取上清液50μl，加入等量Griess试剂，混匀，室温放置3min，于Clinic 128全自动酶标仪570nm处测定光密度(A)值，以NO2-的量表示NO含量，并以NaNO2为标准品绘制标准曲线，将A值换算为μmol/L。
1.5 扫描电镜制样 把腹膜样品切成3×3mm2，依次进行2.5%戊二醛和1%饿酸双固定，2%单宁酸导电处理，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥(仪器型号：Hitachi HCP-2)，喷镀金膜(离子射仪型号：Hitachi E-1020)，Stereoscan S260扫描电镜观察，加速电压20kV。
, http://www.100md.com
1.6 计算机图像处理
1.6.1 计算机图像处理系统组成 本实验采用电镜与计算机联机数字图像处理系统。该系统由摄像机、A/D、Pentium Ⅱ 300和64级灰度/256种伪彩色的高分辨率多扫描彩色显示器(包括VGA适配卡)及软件组成。
1.6.2 系统的主要技术指标 ①系统的灵敏度为0.25Lux；②图像分辨率为512×512×8 bits(正常状态)和256×256×8 bits(增强采样状态)；③图像采集时间为20s/帧，显示图像为64级灰度或256种伪彩色。
1.7 统计学方法 数据以(
±s)表示，组间比较用方差分析，q检验。
2 结 果
, http://www.100md.com 2.1 腹腔巨噬细胞产生NO的动态变化 在PD期间，腹透液可诱生腹腔巨噬细胞产生高浓度的NO，随PD时间延长，NO量大幅度增加。但生理盐水组与正常对照组(NO浓度为11.17±2.05)比较，腹腔巨噬细胞产生NO的差异不显著(P>0.05)。
停止PD，腹透组NO量明显降低。但在停止PD的第10和第20天，腹透组NO量仍高于生理盐水组(P<0.01)，至第40天，腹透组NO量恢复正常(表1)。Table 1. Dynamic changes of NO production at different time of peritoneal dialysis(μmol/L，±s) Groups
Days post-PD
Days after stop of PD
, 百拇医药
10
20
40
10
20
40
NO in PD Group
22.0±1.46*
46.4±1.61**
41.5±4.11*
27.6±1.46*
, http://www.100md.com
28.5±2.00
14.0±1.02
NO in Control group
10.4±1.91
11.9±2.05
9.11±1.32
11.9±0.44
9.80±1.88
13.7±2.05
PD：peritoneal dialysis；NO：nitric oxide
Comparison between PD group and Control group at each time point P<0.01，**P<0.001
, 百拇医药
2.2 腹膜间皮超微病理改变 PD期间，间皮呈渐进变化。PD 10天，间皮细胞细胞衣(cell coat)多己丧失，部分间皮细胞的微绒毛散在脱落(图1)。PD 20天，局部细胞的微绒毛呈灶性脱落，间皮裸露。有团块状微绒毛粘连。PD 40天，有呈地图状的间皮细胞裸露区，偶见局部细胞膜损伤(图1)。停止PD后，间皮细胞的病理改变逐渐修复，到停止PD 40天，腹膜间皮基本恢复正常。
2.3 腹腔巨噬细胞 PD组腹膜间皮游离面，可见由许多巨噬细胞聚集形成的乳斑(milky spot)(图2)。组成乳斑的巨噬细胞多来源于血液系统。它们经腹膜淋巴孔游出，进入腹腔，聚集在腹膜淋巴孔附近或腹膜淋巴孔表面，覆盖腹膜淋巴孔。乳斑的形态大小不一，形态大的乳斑由数百个巨噬细胞组成，面积达0.72 mm2，而小的乳斑仅由数十个细胞形成，面积仅为1730 μm2。构成乳斑的细胞多以单层聚集，偶呈多层堆积。在扫描电镜下观察，多数细胞呈游走状，细胞伸出一些伪足和许多粗大的细胞突起。生理盐水组甚少有乳斑，偶尔发现巨噬细胞亦呈静止状态。
, http://www.100md.com
2.4 腹膜淋巴孔的变化 随PD进展，腹膜淋巴孔开放数量增多，腹膜淋巴孔舒张使孔径逐渐增大，分布密度增高(图3，4)。在PD不同时间段，腹膜淋巴孔变化程度不同，但总的趋势为密度增加和孔径增大。PD 10天，腹膜淋巴孔大小在正常范围(P>0.05)，分布密度则大于生理盐水组(P<0.05)；PD 20天和40天，腹膜淋巴孔明显舒张，孔径增大(P<0.01)，腹膜淋巴孔开放数量增多，使分布密度显著增高(P<0.001)；停止PD，腹膜淋巴孔逐渐恢复正常。但停止PD初期，腹膜淋巴孔分布密度仍高于生理盐水组，此后，腹膜淋巴孔大小和密度均恢复正常(表2，3)。
Table 2. Changes of peritoneal lymphatic stomata diameter
at different time point during peritoneal dialysis(μm，±s) Group
, http://www.100md.com
Days post-PD
Days after stop of PD
10
20
40
10
20
40
PD Group
2.38±0.77
3.12±0.65*
3.48±0.69*
, 百拇医药
2.39±0.73
2.39±0.36*
2.20±0.49
Control group
2.23±0.78
1.93±0.51
2.11±0.62
2.09±0.44
1.97±0.60
2.19±0.54
Comparison between PD group and Control group at each time point *P<0.01Table 3. Changes of peritoneal lymphatic stoma distribution(stomata/1000μm2)at different time point during
, http://www.100md.com
peritoneal dialysis(±s) Group
Days post-PD
Days after stop of PD
10
20
40
10
20
40
stoma density in PD Group
, 百拇医药
4.13±0.92*
6.75±0.87***
7.00±0.71**
7.09±0.99
4.12±0.99
4.72±1.27
stoma density in Control group
3.11±1.27
3.00±0.77
3.18±0.98
, 百拇医药
3.67±0.55
3.40±0.55
3.70±1.15
Comparison between PD group and Control group at each time point：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
Fig.1.Forty days after peritoneal dialysis.
D：denuded mesotheial surface；↑：damaged mesothelium；N：normal mesothelium(Scanning electronic microscopy ×1500)
, 百拇医药
Fig.2.Ten days after peritoneal dialysis.
Formation of milky spot on the macrophagus.
(Scanning electronic microscopy ×1300)
Fig.3.Normal mesothelium and lymphatic stoma in the normal saline control group
(Scanning electronic microscopy ×4000)
, http://www.100md.com
Fig.4.Forty days after peritoneal dialysis.
Extensiue diminution and precipation(▲)of mesothelium microvilli.↑：dilated lymphatic stoma
(Scanning electronic microscopy ×4000)
3 讨 论
长期PD易导致失超滤。失超滤是指PD时透析液流出量明显减少，致使体液潴留，代谢产物体内蓄积，PD效能降低，进而导致PD失败，危及患者生命。所以，研究失超滤的产生机制，对于提高PD超滤能力和患者生存率，具有重要意义。
PD的超滤主要靠血液与腹透液之间的渗透压梯度实现的，其纯超滤为跨腹膜微血管超滤，减去腹膜淋巴孔的淋巴重吸收和血管回渗。后者是因血浆胶体渗透压产生的Starling力作用，直接由毛细血管吸收[6]。通过血管回渗的速度约0.4 ml/min，远慢于经腹膜淋巴孔重吸收速度[7]。当长期PD时，血浆胶体渗透压逐渐降低，借血管回渗的量极少，而腹腔淋巴引流则是持续的，平均每天淋巴重吸收量至少达1升[8]。所以，失超滤的主要原因是腹腔的淋巴重吸收增加。
, 百拇医药
腹腔的淋巴转归依赖腹膜淋巴引流系统(lymphatic drainage system)[9]，包括腹膜淋巴孔、淋巴引流单位(lymphatic drainage unit)和腹膜下淋巴管。腹膜淋巴孔系腹膜下毛细淋巴管在间皮游离面的开口，有主动吸收作用[10]。同时，也是血液系统巨噬细胞进入腹腔发挥免疫效能作用的通路[11]。正常时腹膜淋巴孔承担腹腔内少量物质的转运，有巨大的代偿潜能。当病理状态下，如腹水形成时，腹膜淋巴孔的这种转运作用则大大增强[12]，在PD时，腹腹淋巴孔对腹透液的持续吸收，显得尤为重要。当腹透液与血浆渗透压达到平衡后，PD超滤率基本消失，而腹膜淋巴孔的吸收依然存在，导致了超滤的降低。
在临床上，长期PD患者多有严重的失超滤，并随PD进展而加剧。有资料表明，PD第1年有2.6%～10%的患者出现超滤量的减少，PD第2年可高达30%[13]。PD 5年后，即使用糖浓度为3.86%的高渗腹透液，所产生的超滤效果也仅能达到透析初期的59%[14]。研究发现[15]，使用Baxter腹透液，PD时甚少出现腹膜炎，但与其它腹透液一样，长期使用易产生间皮损伤。这与腹腔巨噬细胞产生的高浓度NO有关。在本实验中，PD组腹膜游离面有大量巨噬细胞，甚至形成乳斑。巨噬细胞产生的NO是一个多功能的调节因子，对机体的作用具有两重性。低浓度NO通过抑制DNA在细胞体内复制，具有抗肿瘤、抗感染、抗真菌和杀伤寄生虫的作用[16]。高浓度NO具有细胞毒性，可损害细胞体内线粒体，并与细胞内含有FeS的酶结合，使其失去功能。细胞接触高浓度NO，可导致细胞溶解[17]。在本实验中也得到证实。随着PD的延长，PD组NO大量增加，引起间皮细胞损伤逐渐加重。停止PD，NO浓度逐渐降低，损伤的间皮开始修复，至停止PD 40天，间皮基本恢复正常。
, 百拇医药
长期PD产生失超滤的机制可能与NO有关。本实验结果表明，随PD延长，NO产量增高，腹膜淋巴孔孔径增大，分布密度增高，使腹膜淋巴孔对腹透液吸收增加。目前已证实，内皮源性血管舒张因子(endothelium-derived relaxing factor， EDRF)即为NO。NO有强烈的松弛血管平滑肌作用，使血管舒张。本文发现，PD时NO产量与腹膜淋巴孔径和分布密度呈正比。因此，NO可能具有舒张淋巴管，扩大腹膜淋巴孔的作用，促使腹膜淋巴孔吸收加速，导致PD失超滤。停止PD后，PD组NO量降低，腹膜淋巴孔的孔径和分布密度亦减少。至停止PD 40天，NO量恢复正常，腹膜淋巴孔的孔径和分布密度亦在正常范围。生理盐水不刺激巨噬细胞，其NO产量与正常组无差异(P>0.05)，腹膜淋巴孔亦正常。所以，作者认为长期PD失超滤可能与高浓度NO舒张腹膜淋巴孔，促腹腔淋巴重吸收增加有密切关系，对此尚有待于作进一步的研究。
参考文献
1，Li J，Zhang X，Chen X et al. Effect of dialysates on the peritoneal stomata and its lymphatic reabsorption.J Jap Soci Dial Ther，1997，30：559
, 百拇医药
2，Abensur H， Romao-Junior JE， Prado EB et al. Use of dextran 70 to estimate peritoneal lymphatic absorption rate in continuous ambulatory peritoneal dialysis. Adve Peritoneal Dialy，1992，8：3
3，李继承，张 凯，钟海玲等.腹透液对小鼠腹膜间皮超微结构影响的研究.中国医学科学院学报，1999，21：208
4，Gotloib L， Waisbrut V，Shostak A et al. Acute and long-term changes observed in imprints of mouse mesothelium exposed to glucoseenriched， lactated， buffered dialysis solutions. Nephron，1995，70：466
, http://www.100md.com
5，Yim CY，Bastian NR， Smith JC et al. Macrophage nitric oxide synthesis delays progression of ultraviolet light-induced murine skin cancers. Cancer Res，1993，53：5507
6， Krediet RT. Fluid absorption in the peritoneum-it is less simple than you thought. Nephrol Dial Transplant，1994，9：341
7，Ofsthum NJ， Shockley TR. Lymphatic and non-lymphatic fluid loss from the peritoneum cavity. Blood Purif，1992，10：113
, 百拇医药
8，李继承，俞寿民.腹膜孔与CAPD的纯超滤.中华肾脏病杂志，1994，10：49
9，Li J， Zhao Z， Zhou J et al. A study of the three-dimensional organization of the human diaphragmatic lymphatic lacunae and lymphatic drainage units. Ann Anat，1996，178：537
10，Li J， Yu S. Study on the ultrastructure of the peritoneal stomata in humans. Acta Anat，1991，141：26
11，李继承，赵章仁，陈汉民等.人与小鼠膈腹膜乳斑的研究.解剖学报，1996，27：89
, http://www.100md.com 12，李继承，石元和，陈肖波等.腹膜孔和腹水转归机制的研究.中国医学科学院学报，1992，14：328
13，Slingenyer A，Canaud B， Mion C. Permanent loss of ultrafiltration of the capacity peritoneum in long-term peritoneal dialysis.A epidemiological study. Nephron，1983，33：133
14，Struijk DG， Krediet RT， Koomen GC. Functional characteristics of the peritoneal membrane in long-term continuous ambulatory peritoneal dialysis. Nephron，1991，59：213
15，张 凯，李继承，陈一芳等.腹膜透析液对小鼠腹膜间皮细胞超微结构影响的比较研究.肾脏病与透析肾移植杂志，1996，5：20
, 百拇医药
16，Hibbs JB.Synthesis of nitric oxide from L-arginine：a recently discovered pathway induced by cytokines with antitumor and antimicrobial activity. Res Immunol，1991，142：565
17，Li LM，Kilbourn RG，Adam ST et al. Role of nitric oxide in lysis of tumor cells by cytokine-activated endothelial cell. Cancer Res， 1991，51：2531
收稿1999-07-23
修回1999-11-01, 百拇医药
单位：李继承(国家自然科学基金资助项目 NO.39970381)；杨泽然(浙江大学医学院淋巴学研究室 杭州，310006)；张凯(杭州红十字会医院肾内科)
关键词：腹膜透析；一氧化氮；腹膜淋巴孔
肾脏病与透析肾移植杂志000104 摘 要 目的：研究腹膜透析(PD)对巨噬细胞产生一氧化氮(nitric oxide，NO)和腹膜淋巴孔的影响，探讨PD失超滤机制。 方法：①应用Baxter腹透液建立PD小鼠模型；②用全自动酶标仪动态测定NO量；③用扫描电镜观察不同时间点腹膜间皮超微病理变化；④使用计算机与扫描电镜联机的图像处理系统，测定不同PD时间点腹膜淋巴孔的改变。 结果：随着PD进行，大量巨噬细胞经腹膜淋巴孔游出，进入腹腔形成乳斑。NO浓度逐渐增高，间皮细胞损伤趋严重，腹膜淋巴孔孔径增大、分布密度增高。停止PD，乳斑减少，NO量逐渐降低，损伤的间皮细胞开始修复，腹膜淋巴孔渐趋正常。至停止PD 40天，间皮细胞基本修复，腹膜淋巴孔恢复正常。 结论：PD使大量巨噬细胞进入腹腔，巨噬细胞产生的高浓度NO可损害间皮细胞、舒张腹膜淋巴孔，可能与腹透液吸收增加，PD失超滤有关。
, 百拇医药
EFFECTS OF PERITONEAL DIALYSIS ON MACROPHAGE NITRIC OXIDE PRODUCTION AND ITS RELATION WITH PERITONEAL LYMPHATIC STOMATA
LI Jicheng YANG Zerang
(Department of Lymphology，Zhejiang University Medical College，Hangzhou，310031)
ZHANG Kai
(Hangzhou Red-Cross Hospital)
OBJECTIVE Long-term peritoneal dialysis inevitably leads to ultrafiltration failure.An animal model was established to study the mechanism of ultrafiltration failure in peritoneal dialysis by analyzing nitric oxide(NO) regulation of peritoneal lymphatics stomata and lymph reabsorption form the peritoneal cavity. METHODOLOGY ①The animal model of peritoneal dialysis was established with the application of Baxter dialysate； ②Dynamic NO measurements were performed during peritoneal dialysis and its cessation； ③Sequential observation of ultra-structural changes in peritoneal mesothelium was made under scanning electron microscope(SEM)at different length of dialysis time； ④Dynamic changes in the peritoneal lymphatic stomata were studied by computer image processing system. RESULTS Numerous macrophages were found to enter peritoneal cavity to form milky spot.Damages of mesothelial cells，increased density of their distribution and enlargement of the peritoneal lymphatic stomata were found to be associated with the increase in macrophage NO quantity during the experiment.The mesothelium damage amelioration and the peritoneal lymphatic stomata recovery were observed with the decreasing NO quantity in peritoneal dialysate.Complete recovery of mesothelium and the peritoneal lymphatic stomata were observed in this model in 40 days after the cessation of peritoneal dialysis. CONCLUSION In long-term peritoneal dialysis，increased peritoneal macrophages is associated with increased NO production，which might damage mesothelium and relax lymphatic stomata leading to the enhanced lymph absorption or ultrafiltration failure.
, 百拇医药
Key words peritoneal dialysis nitric oxide ultrafiltration
腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)作为一种肾脏替代疗法，对改善慢性肾衰患者的临床症状和延长生命起了重要作用。随着PD疗效的逐渐提高，PD患者生存率也逐年提高，长期PD患者增多。然而，随着PD时间的延长，将不可避免地产生失超滤(ultrafiltration failure)，严重降低了PD效能，已成为长期PD患者常见难题。
在临床上，影响PD超滤的主要因素有：①腹透液的糖浓度；②腹膜转运能力；③腹膜淋巴孔的持续吸收作用。对于常规使用的低糖浓度腹透液和特定的PD患者，前两者是恒定的。所以，腹腔淋巴吸收作用是导致PD失超滤的直接因素[1]。通常认为，腹腔淋巴引流是持续的，其速度为1～1.5 ml/min[2]，但是，难以解释随着PD时间延长出现的严重失超滤现象。作者以往的研究认为，长期PD产生炎性粘连，牵拉腹膜淋巴孔，使淋巴孔分布密度和孔径均增大，引起PD后期淋巴重吸收大幅度增加，导致失超滤[3]。虽然，规范化的操作和良好的PD环境，腹膜炎产生的机会甚少，但腹腔淋巴重吸收，随PD延长依然大量增加，因此失超滤同样不可避免。PD时，腹腔淋巴重吸收的调控机制迄今尚无报道。本文旨在通过PD动物模型，研究PD对腹腔巨噬细胞产生NO对腹膜淋巴孔的影响和腹膜间皮超微病理变化，探讨长期PD失超滤的机制。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物 取健康雄性NIH小鼠102只(浙江大学医学院实验动物中心提供)，体重25.5～36.4g。随机分为3组，即腹透液组(n＝36)，生理盐水组(n＝36)和正常对照组(n＝30)。
1.2 腹透液 Baxter腹透液(广州百特药物有限公司产品)，含1.5%葡萄糖的乳酸盐，渗透压346 Osmmol/L，pH 5.2，Ca2+ 3.5 mmol/L，Mg2+0.5 mmol/L，Na+132 mmol/L，Cl-96 mmol/L，HCO-3 40 mmol/L。
1.3 PD动物模型[4] 将腹透液和生理盐水分别注入各组小鼠腹腔，1ml/次，2次/d，间隔8h。在PD的第10、20、40天和停止透析的第10、20、40天取腹膜巨噬细胞测NO产量，取膈腹膜作扫描电镜观察腹膜淋巴孔并进行计算机图像处理。
, 百拇医药
1.4 巨噬细胞诱生处理和NO检测
1.4.1 小鼠处死前4天腹腔注射3%硫乙醇酸盐。收集腹腔巨噬细胞，以D-Hanks液洗涤2次，调细胞浓度至1×109/L，培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，加入96孔板，200 μl/孔，置37℃，5%CO2孵箱中，2h后洗去非贴附细胞，重新加入等量培养液，培养24h后，取上清液，测NO量。
1.4.2 按文献[5]方法，取上清液50μl，加入等量Griess试剂，混匀，室温放置3min，于Clinic 128全自动酶标仪570nm处测定光密度(A)值，以NO2-的量表示NO含量，并以NaNO2为标准品绘制标准曲线，将A值换算为μmol/L。
1.5 扫描电镜制样 把腹膜样品切成3×3mm2，依次进行2.5%戊二醛和1%饿酸双固定，2%单宁酸导电处理，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥(仪器型号：Hitachi HCP-2)，喷镀金膜(离子射仪型号：Hitachi E-1020)，Stereoscan S260扫描电镜观察，加速电压20kV。
, http://www.100md.com
1.6 计算机图像处理
1.6.1 计算机图像处理系统组成 本实验采用电镜与计算机联机数字图像处理系统。该系统由摄像机、A/D、Pentium Ⅱ 300和64级灰度/256种伪彩色的高分辨率多扫描彩色显示器(包括VGA适配卡)及软件组成。
1.6.2 系统的主要技术指标 ①系统的灵敏度为0.25Lux；②图像分辨率为512×512×8 bits(正常状态)和256×256×8 bits(增强采样状态)；③图像采集时间为20s/帧，显示图像为64级灰度或256种伪彩色。
1.7 统计学方法 数据以(
±s)表示，组间比较用方差分析，q检验。2 结 果
, http://www.100md.com 2.1 腹腔巨噬细胞产生NO的动态变化 在PD期间，腹透液可诱生腹腔巨噬细胞产生高浓度的NO，随PD时间延长，NO量大幅度增加。但生理盐水组与正常对照组(NO浓度为11.17±2.05)比较，腹腔巨噬细胞产生NO的差异不显著(P>0.05)。
停止PD，腹透组NO量明显降低。但在停止PD的第10和第20天，腹透组NO量仍高于生理盐水组(P<0.01)，至第40天，腹透组NO量恢复正常(表1)。Table 1. Dynamic changes of NO production at different time of peritoneal dialysis(μmol/L，
±s) GroupsDays post-PD
Days after stop of PD
, 百拇医药
10
20
40
10
20
40
NO in PD Group
22.0±1.46*
46.4±1.61**
41.5±4.11*
27.6±1.46*
, http://www.100md.com
28.5±2.00
14.0±1.02
NO in Control group
10.4±1.91
11.9±2.05
9.11±1.32
11.9±0.44
9.80±1.88
13.7±2.05
PD：peritoneal dialysis；NO：nitric oxide
Comparison between PD group and Control group at each time point P<0.01，**P<0.001
, 百拇医药
2.2 腹膜间皮超微病理改变 PD期间，间皮呈渐进变化。PD 10天，间皮细胞细胞衣(cell coat)多己丧失，部分间皮细胞的微绒毛散在脱落(图1)。PD 20天，局部细胞的微绒毛呈灶性脱落，间皮裸露。有团块状微绒毛粘连。PD 40天，有呈地图状的间皮细胞裸露区，偶见局部细胞膜损伤(图1)。停止PD后，间皮细胞的病理改变逐渐修复，到停止PD 40天，腹膜间皮基本恢复正常。
2.3 腹腔巨噬细胞 PD组腹膜间皮游离面，可见由许多巨噬细胞聚集形成的乳斑(milky spot)(图2)。组成乳斑的巨噬细胞多来源于血液系统。它们经腹膜淋巴孔游出，进入腹腔，聚集在腹膜淋巴孔附近或腹膜淋巴孔表面，覆盖腹膜淋巴孔。乳斑的形态大小不一，形态大的乳斑由数百个巨噬细胞组成，面积达0.72 mm2，而小的乳斑仅由数十个细胞形成，面积仅为1730 μm2。构成乳斑的细胞多以单层聚集，偶呈多层堆积。在扫描电镜下观察，多数细胞呈游走状，细胞伸出一些伪足和许多粗大的细胞突起。生理盐水组甚少有乳斑，偶尔发现巨噬细胞亦呈静止状态。
, http://www.100md.com
2.4 腹膜淋巴孔的变化 随PD进展，腹膜淋巴孔开放数量增多，腹膜淋巴孔舒张使孔径逐渐增大，分布密度增高(图3，4)。在PD不同时间段，腹膜淋巴孔变化程度不同，但总的趋势为密度增加和孔径增大。PD 10天，腹膜淋巴孔大小在正常范围(P>0.05)，分布密度则大于生理盐水组(P<0.05)；PD 20天和40天，腹膜淋巴孔明显舒张，孔径增大(P<0.01)，腹膜淋巴孔开放数量增多，使分布密度显著增高(P<0.001)；停止PD，腹膜淋巴孔逐渐恢复正常。但停止PD初期，腹膜淋巴孔分布密度仍高于生理盐水组，此后，腹膜淋巴孔大小和密度均恢复正常(表2，3)。
Table 2. Changes of peritoneal lymphatic stomata diameter
at different time point during peritoneal dialysis(μm，
±s) Group, http://www.100md.com
Days post-PD
Days after stop of PD
10
20
40
10
20
40
PD Group
2.38±0.77
3.12±0.65*
3.48±0.69*
, 百拇医药
2.39±0.73
2.39±0.36*
2.20±0.49
Control group
2.23±0.78
1.93±0.51
2.11±0.62
2.09±0.44
1.97±0.60
2.19±0.54
Comparison between PD group and Control group at each time point *P<0.01Table 3. Changes of peritoneal lymphatic stoma distribution(stomata/1000μm2)at different time point during
, http://www.100md.com
peritoneal dialysis(
±s) GroupDays post-PD
Days after stop of PD
10
20
40
10
20
40
stoma density in PD Group
, 百拇医药
4.13±0.92*
6.75±0.87***
7.00±0.71**
7.09±0.99
4.12±0.99
4.72±1.27
stoma density in Control group
3.11±1.27
3.00±0.77
3.18±0.98
, 百拇医药
3.67±0.55
3.40±0.55
3.70±1.15
Comparison between PD group and Control group at each time point：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
Fig.1.Forty days after peritoneal dialysis.
D：denuded mesotheial surface；↑：damaged mesothelium；N：normal mesothelium(Scanning electronic microscopy ×1500)
, 百拇医药
Fig.2.Ten days after peritoneal dialysis.
Formation of milky spot on the macrophagus.
(Scanning electronic microscopy ×1300)
Fig.3.Normal mesothelium and lymphatic stoma in the normal saline control group
(Scanning electronic microscopy ×4000)
, http://www.100md.com
Fig.4.Forty days after peritoneal dialysis.
Extensiue diminution and precipation(▲)of mesothelium microvilli.↑：dilated lymphatic stoma
(Scanning electronic microscopy ×4000)
3 讨 论
长期PD易导致失超滤。失超滤是指PD时透析液流出量明显减少，致使体液潴留，代谢产物体内蓄积，PD效能降低，进而导致PD失败，危及患者生命。所以，研究失超滤的产生机制，对于提高PD超滤能力和患者生存率，具有重要意义。
PD的超滤主要靠血液与腹透液之间的渗透压梯度实现的，其纯超滤为跨腹膜微血管超滤，减去腹膜淋巴孔的淋巴重吸收和血管回渗。后者是因血浆胶体渗透压产生的Starling力作用，直接由毛细血管吸收[6]。通过血管回渗的速度约0.4 ml/min，远慢于经腹膜淋巴孔重吸收速度[7]。当长期PD时，血浆胶体渗透压逐渐降低，借血管回渗的量极少，而腹腔淋巴引流则是持续的，平均每天淋巴重吸收量至少达1升[8]。所以，失超滤的主要原因是腹腔的淋巴重吸收增加。
, 百拇医药
腹腔的淋巴转归依赖腹膜淋巴引流系统(lymphatic drainage system)[9]，包括腹膜淋巴孔、淋巴引流单位(lymphatic drainage unit)和腹膜下淋巴管。腹膜淋巴孔系腹膜下毛细淋巴管在间皮游离面的开口，有主动吸收作用[10]。同时，也是血液系统巨噬细胞进入腹腔发挥免疫效能作用的通路[11]。正常时腹膜淋巴孔承担腹腔内少量物质的转运，有巨大的代偿潜能。当病理状态下，如腹水形成时，腹膜淋巴孔的这种转运作用则大大增强[12]，在PD时，腹腹淋巴孔对腹透液的持续吸收，显得尤为重要。当腹透液与血浆渗透压达到平衡后，PD超滤率基本消失，而腹膜淋巴孔的吸收依然存在，导致了超滤的降低。
在临床上，长期PD患者多有严重的失超滤，并随PD进展而加剧。有资料表明，PD第1年有2.6%～10%的患者出现超滤量的减少，PD第2年可高达30%[13]。PD 5年后，即使用糖浓度为3.86%的高渗腹透液，所产生的超滤效果也仅能达到透析初期的59%[14]。研究发现[15]，使用Baxter腹透液，PD时甚少出现腹膜炎，但与其它腹透液一样，长期使用易产生间皮损伤。这与腹腔巨噬细胞产生的高浓度NO有关。在本实验中，PD组腹膜游离面有大量巨噬细胞，甚至形成乳斑。巨噬细胞产生的NO是一个多功能的调节因子，对机体的作用具有两重性。低浓度NO通过抑制DNA在细胞体内复制，具有抗肿瘤、抗感染、抗真菌和杀伤寄生虫的作用[16]。高浓度NO具有细胞毒性，可损害细胞体内线粒体，并与细胞内含有FeS的酶结合，使其失去功能。细胞接触高浓度NO，可导致细胞溶解[17]。在本实验中也得到证实。随着PD的延长，PD组NO大量增加，引起间皮细胞损伤逐渐加重。停止PD，NO浓度逐渐降低，损伤的间皮开始修复，至停止PD 40天，间皮基本恢复正常。
, 百拇医药
长期PD产生失超滤的机制可能与NO有关。本实验结果表明，随PD延长，NO产量增高，腹膜淋巴孔孔径增大，分布密度增高，使腹膜淋巴孔对腹透液吸收增加。目前已证实，内皮源性血管舒张因子(endothelium-derived relaxing factor， EDRF)即为NO。NO有强烈的松弛血管平滑肌作用，使血管舒张。本文发现，PD时NO产量与腹膜淋巴孔径和分布密度呈正比。因此，NO可能具有舒张淋巴管，扩大腹膜淋巴孔的作用，促使腹膜淋巴孔吸收加速，导致PD失超滤。停止PD后，PD组NO量降低，腹膜淋巴孔的孔径和分布密度亦减少。至停止PD 40天，NO量恢复正常，腹膜淋巴孔的孔径和分布密度亦在正常范围。生理盐水不刺激巨噬细胞，其NO产量与正常组无差异(P>0.05)，腹膜淋巴孔亦正常。所以，作者认为长期PD失超滤可能与高浓度NO舒张腹膜淋巴孔，促腹腔淋巴重吸收增加有密切关系，对此尚有待于作进一步的研究。
参考文献
1，Li J，Zhang X，Chen X et al. Effect of dialysates on the peritoneal stomata and its lymphatic reabsorption.J Jap Soci Dial Ther，1997，30：559
, 百拇医药
2，Abensur H， Romao-Junior JE， Prado EB et al. Use of dextran 70 to estimate peritoneal lymphatic absorption rate in continuous ambulatory peritoneal dialysis. Adve Peritoneal Dialy，1992，8：3
3，李继承，张 凯，钟海玲等.腹透液对小鼠腹膜间皮超微结构影响的研究.中国医学科学院学报，1999，21：208
4，Gotloib L， Waisbrut V，Shostak A et al. Acute and long-term changes observed in imprints of mouse mesothelium exposed to glucoseenriched， lactated， buffered dialysis solutions. Nephron，1995，70：466
, http://www.100md.com
5，Yim CY，Bastian NR， Smith JC et al. Macrophage nitric oxide synthesis delays progression of ultraviolet light-induced murine skin cancers. Cancer Res，1993，53：5507
6， Krediet RT. Fluid absorption in the peritoneum-it is less simple than you thought. Nephrol Dial Transplant，1994，9：341
7，Ofsthum NJ， Shockley TR. Lymphatic and non-lymphatic fluid loss from the peritoneum cavity. Blood Purif，1992，10：113
, 百拇医药
8，李继承，俞寿民.腹膜孔与CAPD的纯超滤.中华肾脏病杂志，1994，10：49
9，Li J， Zhao Z， Zhou J et al. A study of the three-dimensional organization of the human diaphragmatic lymphatic lacunae and lymphatic drainage units. Ann Anat，1996，178：537
10，Li J， Yu S. Study on the ultrastructure of the peritoneal stomata in humans. Acta Anat，1991，141：26
11，李继承，赵章仁，陈汉民等.人与小鼠膈腹膜乳斑的研究.解剖学报，1996，27：89
, http://www.100md.com 12，李继承，石元和，陈肖波等.腹膜孔和腹水转归机制的研究.中国医学科学院学报，1992，14：328
13，Slingenyer A，Canaud B， Mion C. Permanent loss of ultrafiltration of the capacity peritoneum in long-term peritoneal dialysis.A epidemiological study. Nephron，1983，33：133
14，Struijk DG， Krediet RT， Koomen GC. Functional characteristics of the peritoneal membrane in long-term continuous ambulatory peritoneal dialysis. Nephron，1991，59：213
15，张 凯，李继承，陈一芳等.腹膜透析液对小鼠腹膜间皮细胞超微结构影响的比较研究.肾脏病与透析肾移植杂志，1996，5：20
, 百拇医药
16，Hibbs JB.Synthesis of nitric oxide from L-arginine：a recently discovered pathway induced by cytokines with antitumor and antimicrobial activity. Res Immunol，1991，142：565
17，Li LM，Kilbourn RG，Adam ST et al. Role of nitric oxide in lysis of tumor cells by cytokine-activated endothelial cell. Cancer Res， 1991，51：2531
收稿1999-07-23
修回1999-11-01, 百拇医药