胸腺瘤相关抗原——人骨骼肌柠檬酸提取物的抗原应用研究
作者：王清华 涂来慧 张仁琴
单位：王清华(264002山东省烟台市解放军107医院神经内科)；涂来慧 张仁琴(第二军医大学附属长海医院神经内科)
关键词：人骨骼肌柠檬酸提取物；重症肌无力；胸腺瘤
临床神经病学杂志000109 【摘要】 目的 研究人骨骼肌柠檬酸提取物(CAE)中胸腺瘤特异相关抗原成份。方法 采用免疫印迹法检测33例重症肌无力(MG)患者(有瘤16例及无瘤17例)，正常人10名和其它疾病18例的血清中CAE抗体。结果 CAE抗原中34 KD、50 KD、60 KD组份与MG有胸腺瘤(MGT)患者的血清结合显色率分别为：93.7%(15/16例)、75%(12/16例)、75%(12/16例)，而其它组无1例结合显色。结论 34 KD、50 KD、60 KD CAE抗原组份为胸腺瘤特异相关成份，可能对MGT的诊断起一定作用。
, 百拇医药
The antigen application of thymoma-associated antigen—citric acid extract of human skeletal muscle
Wang Qinghua,Tu Laihui,Zhang Renqin
(Department of Neurology,People's Liberation Army 107 Hospital,Yantai 264002)
【Abstract】 Objective To study thymoma-specific associated antigen in citric acid extract of human skeletal muscle(CAE).Methods CAE-Abs were evaluated by western blot assay in 33 patients with MG(16 cases with and 17 cases without thymoma),normal adults for 10 cases and 18 cases of other diseases.Results The serum conjugated coloration rates of 34 KD、50 KD、60 KD ingredients of CAE-antigen and MG patients with thymoma were 93.7%(15/16 cases),75%(12/16 cases),75%(12/16 cases) respectively.None of other groups was conjugated coloration.Conclusions 34 KD,50 KD,60 KD ingredients of CAE antigen were specificly related to thymoma, which might play an important role in the diagnosis of MG with thymoma.
, 百拇医药
【Key words】Citric acid extract of human skeletal muscle Myasthenia gravis Thymoma
重症肌无力(MG)合并胸腺瘤(MGT)患者血清中，多种自身抗体效价明显高于无瘤患者。其中抗骨骼肌柠檬酸提取物抗体(CAE-Ab)与胸腺瘤关系密切[1，2]。因此CAE-Ab被称为胸腺瘤相关抗体，CAE则为胸腺瘤相关抗原。CAE为一酸性蛋白质混合物，主要定位于骨骼肌、心肌细胞膜或膜下结构，并且与胸腺瘤上皮细胞膜有交叉抗原[3]。但CAE的主要抗原成份不明。为此本组采用免疫印迹法检测MG患者、正常人及其他疾病对照者共61例血清中CAE-Ab，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 MG组 自1996年～1997年在我院门诊及住院的患者，根据临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激肌电图、血清AchR-Ab或纵隔CT、病理切片等确诊。其中手术后病理证实有胸腺瘤者16例，男9例，女7例，年龄27～70岁，平均50岁；病程2个月～12年，平均4.3年。未发现胸腺瘤的MG患者17例，其中男8例，女9例，年龄19～79岁，平均33.4岁；病程14天～20年，平均4.1年。
, 百拇医药
1.1.2 其他疾病组 18例系非MG其他疾病患者，男10例，女8例，年龄16～64岁，平均36岁。其中多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮各3例，多发性肌炎、肺癌各2例，强直性脊柱炎、周期性麻痹、运动神经元疾病、脊肌萎缩症、Eaton-Lambert综合征各1例。
1.1.3 正常对照组 正常成人10名，男女各5名，年龄18～64岁，平均32.5岁。
1.2 方法
1.2.1 标本采集 各组人员均由肘静脉取血5 ml，分离血清，加适量叠氮钠防腐，置-20 ℃冰箱贮存待检。
1.2.2 试剂及仪器 试剂：DAB(二氨基联苯胺)，AMRESCO公司产品；辣根过氧物酶(HRP)标记羊抗人IgG，华美公司产品；丙烯酰胺、双丙烯酰胺均为Sigma公司产品；低分子量标准蛋白，上海东风生化试剂厂产品。仪器：V16-夹心式垂直电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；DY-A电泳仪(上海生化所申华生化技术开发公司)；硝酸纤维素滤膜 Hybond-N(Amersham公司产品)。
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1.2.3 CAE-Ab检测方法 CAE的提取，按照Aarli报道的方法[1]，用免疫印迹法检测MG病人血清中CAE-Ab[4,5]。将CAE冷干浓缩至10 mg/ml，经样品缓冲处理后，与低分子量marker上样于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔20 μl，50 V电泳2小时。取下凝胶，按半干法转膜2小时，电流0.65 mA/cm2。取下膜剪成几条条带，封闭4℃过夜，加入1∶100稀释的MGT、MGNT、正常人及其他疾病对照血清，4℃2小时。漂洗后，加入HRP标记羊抗人IgG(1∶100稀释)0.1 ml/cm2室温平摇2小时，然后加入新鲜配制DAB/H2O2底物液，显色后，加入PBS液终止反应。收集滤膜条带观察分析。
1.2.4 电泳迁移率的计算 测量染料和蛋白质区带移动的距离，即从分离胶电泳起始处至染料区带孔洞及蛋白质区带中心位置的距离。通常以相对迁移率Rm表示，Rm = 样品移动距离(cm)/ 指示染料移动距离(cm)。
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1.2.5 标准曲线的制作及待测样品分子量的求得。取一半对数纸，直接用表中的标准蛋白分子量和Rm值绘出。根据实验中所得的待测蛋白质样品的Rm值，从标准曲线上求得其分子量。
2 结果
2.1 低分子量marker及样品中胸腺瘤特异相关区带的泳动率及分子量 见表1。标准蛋白分子量与Rm成反比，分子量越大，其电泳迁移率越小。其标准曲线系Rm为横坐标，分子量的对数值为纵坐标的一直线。胸腺瘤特异相关区带分子量分别为34 KD、50 KD、60 KD。
表1 分子量marker及样品中胸腺瘤特异
相关区带的泳动率及分子量 蛋白质
分子量
移动距离(cm)
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相对泳动率Rm
蛋白质
溴酚蓝
磷酸化酶 B
94000
0.8
10
0.08
牛血清白蛋白
67000
1.7
10
0.17
, 百拇医药
肌动蛋白
43000
2.9
10
0.29
碳酸酐酶
30000
3.9
10
0.39
烟草花叶病
17500
5.4
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10
0.54
毒外壳蛋白
Taa*区带1
34000
3.5
10
0.35
Taa*区带2
50000
2.5
10
, 百拇医药 0.25
Taa*区带3
60000
2.0
10
0.20
(Taa* Thymoma-specific associated antigen)
2.2 CAE抗原组份 34 KD、50 KD、60 KD多肽区带与MGT病人血清结合率分别为15/16例(93.7%)、12/16例(75%)、12/16例(75%)。然而在MGNT及单纯胸腺瘤不伴MG病人和其他疾病对照组中无1例结合。而CAE抗原在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离出十几条区带。其中100 KD、110 KD、125 KD区带组份与MG病人、正常人及部分对照疾病呈结合反应；84 KD、92 KD、99 KD组份则与16例MGT病人和2例MGNT病人及多发性肌炎患者呈结合反应；72 KD组份除与MGT病人结合外，还与多发性肌炎患者相结合。
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3 讨论
本实验结果显示CAE抗原中34 KD、50 KD、60 KD多肽在大多数MGT病人中显色，而非瘤组及其他对照组中无1例显色。提示CAE抗原的34 KD、50 KD、60 KD组份为胸腺瘤特异相关的抗原。CAE 100 KD、110 KD、125 KD区带与MG病人、正常人及部分其他疾病患者均有结合反应。CAE中84 KD、92 KD、99 KD组份与MGT病人和2例MGNT病人及多发性肌炎患者结合。72 KD则除与MGT病人结合外，还与多发性肌炎患者相结合。由此看来，这些区带组份均为胸腺瘤非特异性抗原。以往研究发现CAE作为胸腺瘤相关抗原，主要定位于心肌及骨骼肌细胞膜或膜下结构，而且在胸腺瘤上皮细胞膜上有其交叉抗原表达，而在非瘤MG患者及单纯胸腺瘤不伴MG患者胸腺及胸腺瘤上皮细胞膜上则无其交叉抗原存在，并且血清中也无CAE-Ab表达。因此CAE抗原和胸腺瘤之间关系密切。本研究结果进一步显示CAE中34 KD、50 KD、60 KD多肽成份与胸腺瘤之间具有更高的相关特异性。MGT患者血清中存在多种自身抗体。其中与胸腺瘤相关特异性较强的有CAE-Ab[1，2]和titin-Ab[6]。CAE-Ab在MGT病人血清中阳性率为80%～90%，而titin-Ab阳性率为97%。Titin又名肌联蛋白，位于骨骼肌细胞肌浆内，跨越M线与Z线之间的范围，它的功能是粗肌丝与Z线之间的弹性联结及调节粗肌丝上myosin与其他蛋白排列。Titin分子量约为2800 KD。Aarli等采用免疫印迹法检测titin-Ab，发现MGT病人血清抗体主要针对titin中一多肽成份，其分子量巨大(>500 KD)[7]，比本组实验CAE中胸腺瘤特异性抗原分子量大得多。因此看来CAE中胸腺瘤特异性抗原与titin并不是同一种物质。而Aarli等[7]研究发现兔抗人CAE抗体也能与titin中这一多肽成份结合反应，因此CAE与titin之间可能有抗原交叉性。这两种抗原与胸腺瘤关系密切，其机理有待于进一步研究。
, 百拇医药
本实验建立免疫印迹法检测MG病人血清中的CAE-Ab。CAE中34 KD、50 KD、60 KD区带多肽为胸腺瘤特异相关抗原，这些区带中一条以上显色即为阳性。本组检测的MGT病人16例全部阳性，非瘤组无1例假阳性。免疫印迹法具有特异性高、灵敏度强的特点。但免疫印迹法检查操作复杂，花费较高，不能成批检查病人，因而推广应用有一定难度。当今分子克隆技术发展迅速，若能克隆出大量胸腺瘤特异抗原，则对胸腺瘤的诊断、研究MG和胸腺瘤的发病机理更有深远意义。
参 考 文 献
1，Aarli JA，Lefvert AK，Tonder O. Thymoma-specific antibodies in sera from patients with myasthenia gravis demonstrated by indirect haemagglutination. J Neuroimmunol，1981，1：421
, http://www.100md.com
2，涂来慧,张仁琴,黄德仁.用柠檬酸提取人类骨骼肌蛋白抗原检测胸腺瘤相关抗体的临床应用价值.第二军医大学学报，1992，13：547
3，Gilhus NE, Aarli JA,Matre R. Myasthenia Gravis, difference between thymoma-associated antibodies and cross-striational skeletal muscle antibodies.Neurology,1984, 34：246
4，Kuks JBM, Limburg PC, Horst G.et al.Antibodies to skeletal muscle in myasthenia gravis:part l. Diagnostic value for the detection of thymoma.J Neurol Sci,1993，119：183
, 百拇医药
5，J萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学技术出版社，1993.888～897
6，Gautel M，Lakey A，Barlow DP，et al.Titin antibodies in Myasthenia gravis：Identification of a major immunogenic region of titin. Neurology，1993，43：1581
7，Aarli JA，Stefansson K，Marton LSG，et al.Patients with myasthenia gravis and thymoma have in their sera IgG autoantibodies against titin. Clin Exp Immunol，1990，82：289
收稿1999-06-04 修回1999-08-19, 百拇医药
单位：王清华(264002山东省烟台市解放军107医院神经内科)；涂来慧 张仁琴(第二军医大学附属长海医院神经内科)
关键词：人骨骼肌柠檬酸提取物；重症肌无力；胸腺瘤
临床神经病学杂志000109 【摘要】 目的 研究人骨骼肌柠檬酸提取物(CAE)中胸腺瘤特异相关抗原成份。方法 采用免疫印迹法检测33例重症肌无力(MG)患者(有瘤16例及无瘤17例)，正常人10名和其它疾病18例的血清中CAE抗体。结果 CAE抗原中34 KD、50 KD、60 KD组份与MG有胸腺瘤(MGT)患者的血清结合显色率分别为：93.7%(15/16例)、75%(12/16例)、75%(12/16例)，而其它组无1例结合显色。结论 34 KD、50 KD、60 KD CAE抗原组份为胸腺瘤特异相关成份，可能对MGT的诊断起一定作用。
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The antigen application of thymoma-associated antigen—citric acid extract of human skeletal muscle
Wang Qinghua,Tu Laihui,Zhang Renqin
(Department of Neurology,People's Liberation Army 107 Hospital,Yantai 264002)
【Abstract】 Objective To study thymoma-specific associated antigen in citric acid extract of human skeletal muscle(CAE).Methods CAE-Abs were evaluated by western blot assay in 33 patients with MG(16 cases with and 17 cases without thymoma),normal adults for 10 cases and 18 cases of other diseases.Results The serum conjugated coloration rates of 34 KD、50 KD、60 KD ingredients of CAE-antigen and MG patients with thymoma were 93.7%(15/16 cases),75%(12/16 cases),75%(12/16 cases) respectively.None of other groups was conjugated coloration.Conclusions 34 KD,50 KD,60 KD ingredients of CAE antigen were specificly related to thymoma, which might play an important role in the diagnosis of MG with thymoma.
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【Key words】Citric acid extract of human skeletal muscle Myasthenia gravis Thymoma
重症肌无力(MG)合并胸腺瘤(MGT)患者血清中，多种自身抗体效价明显高于无瘤患者。其中抗骨骼肌柠檬酸提取物抗体(CAE-Ab)与胸腺瘤关系密切[1，2]。因此CAE-Ab被称为胸腺瘤相关抗体，CAE则为胸腺瘤相关抗原。CAE为一酸性蛋白质混合物，主要定位于骨骼肌、心肌细胞膜或膜下结构，并且与胸腺瘤上皮细胞膜有交叉抗原[3]。但CAE的主要抗原成份不明。为此本组采用免疫印迹法检测MG患者、正常人及其他疾病对照者共61例血清中CAE-Ab，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 MG组 自1996年～1997年在我院门诊及住院的患者，根据临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激肌电图、血清AchR-Ab或纵隔CT、病理切片等确诊。其中手术后病理证实有胸腺瘤者16例，男9例，女7例，年龄27～70岁，平均50岁；病程2个月～12年，平均4.3年。未发现胸腺瘤的MG患者17例，其中男8例，女9例，年龄19～79岁，平均33.4岁；病程14天～20年，平均4.1年。
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1.1.2 其他疾病组 18例系非MG其他疾病患者，男10例，女8例，年龄16～64岁，平均36岁。其中多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮各3例，多发性肌炎、肺癌各2例，强直性脊柱炎、周期性麻痹、运动神经元疾病、脊肌萎缩症、Eaton-Lambert综合征各1例。
1.1.3 正常对照组 正常成人10名，男女各5名，年龄18～64岁，平均32.5岁。
1.2 方法
1.2.1 标本采集 各组人员均由肘静脉取血5 ml，分离血清，加适量叠氮钠防腐，置-20 ℃冰箱贮存待检。
1.2.2 试剂及仪器 试剂：DAB(二氨基联苯胺)，AMRESCO公司产品；辣根过氧物酶(HRP)标记羊抗人IgG，华美公司产品；丙烯酰胺、双丙烯酰胺均为Sigma公司产品；低分子量标准蛋白，上海东风生化试剂厂产品。仪器：V16-夹心式垂直电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；DY-A电泳仪(上海生化所申华生化技术开发公司)；硝酸纤维素滤膜 Hybond-N(Amersham公司产品)。
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1.2.3 CAE-Ab检测方法 CAE的提取，按照Aarli报道的方法[1]，用免疫印迹法检测MG病人血清中CAE-Ab[4,5]。将CAE冷干浓缩至10 mg/ml，经样品缓冲处理后，与低分子量marker上样于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔20 μl，50 V电泳2小时。取下凝胶，按半干法转膜2小时，电流0.65 mA/cm2。取下膜剪成几条条带，封闭4℃过夜，加入1∶100稀释的MGT、MGNT、正常人及其他疾病对照血清，4℃2小时。漂洗后，加入HRP标记羊抗人IgG(1∶100稀释)0.1 ml/cm2室温平摇2小时，然后加入新鲜配制DAB/H2O2底物液，显色后，加入PBS液终止反应。收集滤膜条带观察分析。
1.2.4 电泳迁移率的计算 测量染料和蛋白质区带移动的距离，即从分离胶电泳起始处至染料区带孔洞及蛋白质区带中心位置的距离。通常以相对迁移率Rm表示，Rm = 样品移动距离(cm)/ 指示染料移动距离(cm)。
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1.2.5 标准曲线的制作及待测样品分子量的求得。取一半对数纸，直接用表中的标准蛋白分子量和Rm值绘出。根据实验中所得的待测蛋白质样品的Rm值，从标准曲线上求得其分子量。
2 结果
2.1 低分子量marker及样品中胸腺瘤特异相关区带的泳动率及分子量 见表1。标准蛋白分子量与Rm成反比，分子量越大，其电泳迁移率越小。其标准曲线系Rm为横坐标，分子量的对数值为纵坐标的一直线。胸腺瘤特异相关区带分子量分别为34 KD、50 KD、60 KD。
表1 分子量marker及样品中胸腺瘤特异
相关区带的泳动率及分子量 蛋白质
分子量
移动距离(cm)
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相对泳动率Rm
蛋白质
溴酚蓝
磷酸化酶 B
94000
0.8
10
0.08
牛血清白蛋白
67000
1.7
10
0.17
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肌动蛋白
43000
2.9
10
0.29
碳酸酐酶
30000
3.9
10
0.39
烟草花叶病
17500
5.4
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10
0.54
毒外壳蛋白
Taa*区带1
34000
3.5
10
0.35
Taa*区带2
50000
2.5
10
, 百拇医药 0.25
Taa*区带3
60000
2.0
10
0.20
(Taa* Thymoma-specific associated antigen)
2.2 CAE抗原组份 34 KD、50 KD、60 KD多肽区带与MGT病人血清结合率分别为15/16例(93.7%)、12/16例(75%)、12/16例(75%)。然而在MGNT及单纯胸腺瘤不伴MG病人和其他疾病对照组中无1例结合。而CAE抗原在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离出十几条区带。其中100 KD、110 KD、125 KD区带组份与MG病人、正常人及部分对照疾病呈结合反应；84 KD、92 KD、99 KD组份则与16例MGT病人和2例MGNT病人及多发性肌炎患者呈结合反应；72 KD组份除与MGT病人结合外，还与多发性肌炎患者相结合。
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3 讨论
本实验结果显示CAE抗原中34 KD、50 KD、60 KD多肽在大多数MGT病人中显色，而非瘤组及其他对照组中无1例显色。提示CAE抗原的34 KD、50 KD、60 KD组份为胸腺瘤特异相关的抗原。CAE 100 KD、110 KD、125 KD区带与MG病人、正常人及部分其他疾病患者均有结合反应。CAE中84 KD、92 KD、99 KD组份与MGT病人和2例MGNT病人及多发性肌炎患者结合。72 KD则除与MGT病人结合外，还与多发性肌炎患者相结合。由此看来，这些区带组份均为胸腺瘤非特异性抗原。以往研究发现CAE作为胸腺瘤相关抗原，主要定位于心肌及骨骼肌细胞膜或膜下结构，而且在胸腺瘤上皮细胞膜上有其交叉抗原表达，而在非瘤MG患者及单纯胸腺瘤不伴MG患者胸腺及胸腺瘤上皮细胞膜上则无其交叉抗原存在，并且血清中也无CAE-Ab表达。因此CAE抗原和胸腺瘤之间关系密切。本研究结果进一步显示CAE中34 KD、50 KD、60 KD多肽成份与胸腺瘤之间具有更高的相关特异性。MGT患者血清中存在多种自身抗体。其中与胸腺瘤相关特异性较强的有CAE-Ab[1，2]和titin-Ab[6]。CAE-Ab在MGT病人血清中阳性率为80%～90%，而titin-Ab阳性率为97%。Titin又名肌联蛋白，位于骨骼肌细胞肌浆内，跨越M线与Z线之间的范围，它的功能是粗肌丝与Z线之间的弹性联结及调节粗肌丝上myosin与其他蛋白排列。Titin分子量约为2800 KD。Aarli等采用免疫印迹法检测titin-Ab，发现MGT病人血清抗体主要针对titin中一多肽成份，其分子量巨大(>500 KD)[7]，比本组实验CAE中胸腺瘤特异性抗原分子量大得多。因此看来CAE中胸腺瘤特异性抗原与titin并不是同一种物质。而Aarli等[7]研究发现兔抗人CAE抗体也能与titin中这一多肽成份结合反应，因此CAE与titin之间可能有抗原交叉性。这两种抗原与胸腺瘤关系密切，其机理有待于进一步研究。
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本实验建立免疫印迹法检测MG病人血清中的CAE-Ab。CAE中34 KD、50 KD、60 KD区带多肽为胸腺瘤特异相关抗原，这些区带中一条以上显色即为阳性。本组检测的MGT病人16例全部阳性，非瘤组无1例假阳性。免疫印迹法具有特异性高、灵敏度强的特点。但免疫印迹法检查操作复杂，花费较高，不能成批检查病人，因而推广应用有一定难度。当今分子克隆技术发展迅速，若能克隆出大量胸腺瘤特异抗原，则对胸腺瘤的诊断、研究MG和胸腺瘤的发病机理更有深远意义。
参 考 文 献
1，Aarli JA，Lefvert AK，Tonder O. Thymoma-specific antibodies in sera from patients with myasthenia gravis demonstrated by indirect haemagglutination. J Neuroimmunol，1981，1：421
, http://www.100md.com
2，涂来慧,张仁琴,黄德仁.用柠檬酸提取人类骨骼肌蛋白抗原检测胸腺瘤相关抗体的临床应用价值.第二军医大学学报，1992，13：547
3，Gilhus NE, Aarli JA,Matre R. Myasthenia Gravis, difference between thymoma-associated antibodies and cross-striational skeletal muscle antibodies.Neurology,1984, 34：246
4，Kuks JBM, Limburg PC, Horst G.et al.Antibodies to skeletal muscle in myasthenia gravis:part l. Diagnostic value for the detection of thymoma.J Neurol Sci,1993，119：183
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5，J萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学技术出版社，1993.888～897
6，Gautel M，Lakey A，Barlow DP，et al.Titin antibodies in Myasthenia gravis：Identification of a major immunogenic region of titin. Neurology，1993，43：1581
7，Aarli JA，Stefansson K，Marton LSG，et al.Patients with myasthenia gravis and thymoma have in their sera IgG autoantibodies against titin. Clin Exp Immunol，1990，82：289
收稿1999-06-04 修回1999-08-19, 百拇医药