当前位置: 首页 > 期刊 > 《临床神经病学杂志》 > 2000年第1期
编号:10253542
新生大鼠缺氧缺血脑损伤后bcl-x mRNA的表达
http://www.100md.com 《临床神经病学杂志》 2000年第1期
     作者:周伟 吴圣楣 陈惠金 蒲蜀湘

    单位:周伟(510282第一军医大学珠江医院儿科);吴圣楣 陈惠金(上海市儿科医学研究所);蒲蜀湘(广州医学院附属第二医院神经内科)

    关键词:脑缺氧;脑缺血;bcl-x

    临床神经病学杂志000102 【摘要】 目的 探讨新生大鼠脑缺氧缺血后死亡相关基因bcl-x mRNA表达的变化及其与脑缺氧缺血所致细胞凋亡的关系。方法 通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑病动物模型,应用快速竞争性RT-PCR技术对缺氧缺血后不同时间点的缺血侧大脑组织中bcl-x mRNA的表达进行半定量分析,并在相同缺血基础上观察缺氧1.5小时、2.5小时和3.5小时对bcl-x mRNA表达的影响。结果 缺氧缺血后,新生大鼠脑bcl-xs(bcl-x短型) mRNA 的表达自缺氧结束后即刻即有明显增强,24小时达高峰,此后逐渐下降, 7天时回复至正常基线水平。随着缺氧时间的延长即缺氧程度的加重,bcl-xs mRNA的表达有增强趋势,缺氧1.5小时组、2.5小时组及3.5小时组之间bcl-xs mRNA表达水平的差异均具显著性意义(P<0.01)。bcl-xs mRNA的表达高峰与缺氧缺血后脑细胞凋亡的高峰时相相吻合。缺氧缺血对bcl-xl(bcl-x长型) mRNA的表达无影响。结论缺氧缺血可诱导新生大鼠脑bcl-xs mRNA表达增强。在一定范围内,其表达强度与缺氧程度成正相关。bcl-xs过表达在缺氧缺血后脑细胞凋亡的调控过程中起着一定的作用。
, 百拇医药
    Expression of bcl-x mRNA in the neonatal rats following cerebral hypoxia-ischemia

    Zhou Wei, Wu Shengmei, Chen Huijin,et al

    (Department of Pediatrics, Zhujiang Hospital, First Military Medical University,Guangzhou 510282)

    【Abstract】 Objective To study the changes on the expression of bcl-x mRNA follo-wing hypoxia-ischemia(HI) in the neonatal rat brain and the relationship between bcl-x mRNA expression and apoptosis in the hypoxic-ischemic developing brain. Methods The animal models of HI brain damage were made. Rapid competitive reverse transcriptase-PCR(RT-PCR) was used to analyze the expression of bcl-x mRNA semi-quantity in the hemisphere subjected to both ligation and hypoxia at different time points after HI. The effect of different hypoxic time of 1.5 h,2.5 h and 3.5 h on the expression of bcl-x mRNA was also evaluated based on the same ischemic models. Results The expression of bcl-xs (short form) mRNA in the neonatal rat brain increased markedly at the termination of hypoxic exposure, peaked at 24 h, and then decreased gradually and returned to baseline at 7 d. The levels of bcl-xs mRNA increased with prolonging the duration of hypoxia. The significant differences were found between 1.5 h, 2.5 h and 3.5 h hypoxia group, respectively. The peak time of the overexpression of bcl-xs mRNA was coordinate with the peak of apoptosis following HI. HI had no effect on the expression of bcl-xl(long form) mRNA.Conclusion HI could increase the expression of bcl-xs mRNA in the neonatal rat brain. Within a certain extent, the expression of bcl-xs was positively related to the degree of hypoxia. The overexpression of bcl-xs could play a role in the induction of apoptosis following cerebral HI.
, 百拇医药
    【Key words】Cerebral hypoxia Cerebral ischemia bcl-x

    Bcl-2基因家族及其编码的蛋白质在细胞凋亡调控过程中起着重要作用,但有关bcl-x基因在脑缺氧缺血后调控方面的报道较少。本研究拟利用新生大鼠脑缺氧缺血模型,应用快速竞争性RT-PCR技术检测缺氧缺血后不同时间脑内bcl-x mRNA的表达及不同缺氧程度对其表达的影响,并探讨其意义。

    1 材料与方法

    1.1 材料 将80只新生大鼠随机分为2组,每组40只,一组行颈正中切口后即缝合皮肤作为正常对照(N), 另一组为缺氧缺血实验组(HI)。于缺氧结束后不同时间点0、2、6、12、24、48、72小时及7天断颈处死(每个时间点5只)。另取27只新生大鼠随机分为3组,每组9只,在结扎右侧颈总动脉后分别予以缺氧(8%O2+92%N2)1.5小时、2.5小时和3.5小时,于缺氧结束后6小时、24小时及48小时断颈处死(每个时间点3只)。自丘脑中1/3水平取实验侧(右侧)大脑半球组织约50 mg冻存于-80℃冰箱备用。
, 百拇医药
    1.2 方法

    1.2.1 新生大鼠脑缺氧缺血模型的制作 参照Rice方法[1],生后7天的SD大鼠(购自中科院上海实验动物中心),取仰卧位,四肢固定于手术板上,颈正中切口,游离右侧颈总动脉,用5-0丝线结扎,缝合切口后置于2000 ml密闭容器,该容器置于37℃水浴中。以1~2 L/min的速度输入含8%氧气、92%氮气的混合气体,持续2.5小时。

    1.2.2 引物的设计与合成 从基因文库中查到大白鼠bcl-x基因cDNA序列,应用Oligo 5.0软件程序设计有意义、反意义引物,设计的此对引物其扩增片段有2个,即bcl-xl(482bp)和bcl-xs(293bp)。另设计一个反意义竞争引物(包含反意义引物另加25个碱基序列),其扩增片段比目的片段分别短286 bp和97bp(见表1)。引物由美国CyberSyn生物工程公司合成。

    表1 引物序列及其在bcl-x基因组中的位置
, 百拇医药
    核酸序列

    位置

    产物大小

    bcl-x mRNA

    Sense(a)

    5'-ATCAATGGCAACCCATCCTGGCACC-3'

    170-194

    482bp

    Antisense(b)

    5'-TTGAAACGCTCCTGGCCTTTCCGGC-3'

    651-627
, 百拇医药
    293bp

    bcl-x competitor

    Sense(a)

    5'-ATCAATGGCAACCCATCCTGGCACC-3'

    170-194

    Antisense(c)

    5'-TTGAAACGCTCCTGGCCTTTCCGGC

    651-627+

    ATCACTGAATGCTCTCCGGTACCGC-3'

    340-316
, 百拇医药
    196bp

    1.2.3 特定竞争性内参照的制备 特定竞争性内参照(internal standard, IS)的制备参照文献进行[2]。利用缺氧缺血后12小时的大鼠脑组织标本提取RNA,逆转录成cDNA; 然后用引物a、c进行PCR扩增,琼脂糖(Promega)凝胶电泳,胶回收(采用上海华舜生物工程公司生产的柱离心式胶回收试剂盒);再利用引物a、b对稀释后的回收产物进行第2次PCR扩增,以提高纯度、增加得率。电泳、回收后定量。并用不同稀释度的IS(64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 fg)与一定量的目的cDNA竞争,以选择IS的最佳竞争浓度。

    1.2.4 快速竞争性RT-PCR 采用上海华舜生物工程公司生产的柱离心式组织/细胞RNA抽提试剂盒提取RNA,PE Lamda 10紫外/可见光分光光度计定量及电泳确定RNA质量。取2 μg总RNA按逆转录试剂盒(Promega, U.S.A.)说明进行逆转录,然后在Gene Amp PCR System 2400(Gene, U.S.A.)上行PCR。总反应体系为25 μl,其中包括:10×PCR缓冲液(内含15 mmol/L MgCl2)2.5 μl, 4×10 nM dNTP (Promega) 1 μl,12.5 pmol 的引物a、b各1 μl,Taq DNA聚合酶(Promega) 1 μl (1 U/μl),目的cDNA 3 μl(0.3 μg),IS 1 μl(2 fg),灭菌去离子水14.5 μl。反应条件是:94℃预变性5 分钟,继之以94℃变性45 秒,60℃退火45 秒,72℃延伸1 分钟,共28个循环,最后一个循环后72℃再延伸7分钟,4℃保存。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴乙锭)电泳后用凝胶成像仪观察结果。计算PCR产物bcl-x cDNA 与IS的荧光密度比作为bcl-x基因的相对表达强度。
, 百拇医药
    2 结果

    2.1 RNA抽提、cDNA逆转录及PCR扩增的效率 用柱离心式组织/细胞总RNA抽提试剂盒提取的总RNA的A260 nm/A280 nm为1.9~2.0,变性电泳28 S与18 S之比约为2∶1,说明RNA未发生明显的降解。各样本相同量cDNA用β-actin引物进行PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳显示各样本β-actin mRNA水平相近(电泳条带荧光密度相近),表明样本间反转录效率基本一致。对缺氧缺血后12小时的大鼠脑组织提取得到的总RNA进行逆转录并经PCR扩增, bcl-x分别在482 bp(bcl-xl)、293 bp(bcl-xs)及196 bp(bcl-x competitor)处出现一条背景清晰条带, mRNA表达无基因组DNA干扰。在25~32个PCR循环内,PCR产物与循环圈数呈平行扩增,且目的基因与内参照的比率基本保持恒定。比较组织中特异mRNA的相对含量应在其指数扩增区内进行。

    2.2 特定竞争性内标量的确定 选择目的条带与竞争条带均较明显的电泳泳道含量(第6泳道,2 fg),即为较合适的竞争水平。
, 百拇医药
    2.3 新生大鼠缺氧缺血后脑内bcl-x基因表达的动态变化 正常情况下,新生大鼠脑内一般无可检测水平的bcl-xs mRNA表达或表达很弱。缺氧缺血可诱导其表达增加。bcl-xs mRNA的表达自缺氧结束后即刻即有明显增强,缺氧缺血后24小时其表达达高峰,此后开始回落,7天时已无可检测水平的表达。正常情况下,bcl-xl mRNA在新生大鼠脑内即有很强的表达,缺氧缺血对其表达无明显影响。

    2.4 不同缺氧程度对bcl-x基因表达的影响 在一定范围内,于缺血的基础上,随着缺氧时间的延长(即缺氧程度的加重),bcl-xs mRNA的表达有增强的趋势。缺氧1.5小时组、2.5小时组及3.5小时组之间bcl-xs mRNA表达水平均有显著性差异。

    3 讨论

    Bcl-2基因家族包括bcl-2, bcl-x, bax等。已发现在中枢神经系统有bcl-2的表达,并且不同的干预和刺激,通过bcl-2基因的表达及其蛋白增加的机理能抑制细胞凋亡从而提高细胞的存活能力[3]。Bax是bcl-2的同种性蛋白,并可与之结合形成同型二聚体或异型二聚体,两者的比例决定了细胞的命运。若bax占多数,则bcl-2被抑制,凋亡被诱导,细胞死亡;反之,则bax受到抑制,细胞得以生存[4]。bcl-x基因也具有调节细胞死亡的功能。bcl-x转录编码了两种不同的bcl-x mRNA,即 bcl-xl(long form),作用与bcl-2相似,抑制细胞凋亡;bcl-xs(short form),可抑制bcl-2和bcl-xl的活性,与bax作用相似,促进细胞凋亡[5]
, 百拇医药
    新生动物脑缺氧缺血后可引起许多基因表达的改变,如bcl-2, bax, c-fos, c-jun等,从而引发一系列细胞凋亡事件。但目前尚未见新生动物缺氧缺血后脑内bcl-x mRNA表达的报道。本研究利用脑缺氧缺血新生大鼠模型,发现脑缺氧缺血可诱导bcl-xs mRNA的表达。缺氧结束后即刻bcl-xs mRNA的表达水平即明显升高,缺氧缺血后24小时左右其表达水平达高峰,此后逐渐下降,7天时回复至正常基线水平。而bcl-xl mRNA的表达无明显改变。Dixon等[5]利用暂时性前脑缺血(4-血管阻断30分钟)成年大鼠模型观察了bcl-x mRNA表达及其蛋白质合成情况,也发现缺血后72小时其海马CA1区bcl-x mRNA的表达较非缺血区对照组增加3~4倍。由于他们的PCR MIMIC所用引物未能分辨bcl-xl与bcl-xs,故测定的仅是总的bcl-x mRNA, 进一步采用Western blot分析则显示缺血后促凋亡蛋白bcl-xs增加而抗凋亡蛋白bcl-xl无变化。因此他们推断缺血诱导bcl-x mRNA表达增加的只是其中的bcl-xs mRNA。 本研究也得到了类似的结果。
, http://www.100md.com
    本研究结果还表明,一定范围内,bcl-xs mRNA的表达强度与缺氧严重程度呈正相关。说明缺氧程度越重,受到累及的神经元及其它组织越广泛。

    在我们另外的实验中,利用TUNEL标记检测缺氧缺血后脑细胞凋亡表明,在缺氧结束后6小时,与结扎颈动脉同侧的脑皮质、海马等有一些细胞开始被TUNEL所标记,随后TUNEL阳性细胞核数目增加,在24小时最显著。这与脑缺氧缺血后bcl-xs mRNA的表达高峰相吻合。可以推测,bcl-xs基因被诱导在缺氧缺血后脑细胞凋亡的调控过程中起着一定的作用。但Dixon等[5]的研究显示,脑缺血成年大鼠虽然其bcl-x mRNA表达显著增强,但其翻译产物bcl-xs与bcl-xl之比率甚低,说明bcl-xs蛋白合成量很少。因此,缺氧缺血后bcl-xs基因及其编码的蛋白质在脑细胞凋亡调控过程中起到的作用可能是有限的。

    参 考 文 献

    1,Rice JE, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol,1981,9:131
, 百拇医药
    2,Jiang YH, Davidson LA, Lupton JR, et al. Rapid competitive PCR determination of relative gene expression in limiting tissue samples. Clin Chem, 1996,42:227

    3,Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science, 1995,267:1445

    4,Oltvai ZN, Milliman CL,Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993, 74:609

    5,Dixon EP, Stephenson DT, Clemens JA, et al. Bcl-Xshort is elevated following severe global ischemia in rat brains. Brain Res, 1997,776:222

    收稿1999-08-08 修回1999-11-01, http://www.100md.com