大鼠脑缺血再灌注与蛋白激酶C活性变化及FOS、BCL-2的表达
作者：李云峰 陈康宁 郑彩梅
单位：李云峰(250031济南军区总医院神经内二科)；陈康宁 郑彩梅(第三军医大学西南医院神经内科)
关键词：脑缺血；再灌注；蛋白激酶C；FOS；BCL-2
临床神经病学杂志000101 【摘要】 目的 探讨大鼠脑缺血再灌注时蛋白激酶C(PKC)活性的变化与FOS、BCL-2表达的关系。方法 采用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，用磷基转移片检测PKC的活性，用免疫组化法检测BCL-2及FOS的含量。结果 缺血再灌注后膜PKC活性持续增加，FOS在缺血再灌注早期即有明显增加，至缺血再灌注2天时仍有少量表达。BCL-2表达的高峰是在缺血再灌注2天时。结论 缺血再灌注期间PKC发生易位激活，PKC促进了FOS和BCL-2的表达，这几个因素综合作用影响神经细胞凋亡。
PKC activity,FOS and BCL-2 expression after cerebral ischemia-reperfusion in rats
, http://www.100md.com
Li Yunfeng,Chen Kangning,Zheng Caimei
(Department of Neurology, Jinan Military Gene-ral Hospital, Jinan 250031)
【Abstract】 Objective To research the relationship between the change of protein kinase C(PKC) activity and the expression of FOS, BCL-2 during cerebral ischemia-reperfusion.Methods Middle cerebral artery ischemia-reperfusion model was established in Wistar rats. In these regions the changes of PKC activity were measured by phosphoryl transfer pieces. The contents of BCL-2 and FOS were observed with immunohistochemistry.Results The PKC activity in membrane increased continuously after cerebral ischemia-reperfusion.FOS increased remarkably at early stage of reperfusion,there was a small amount expression till 2 d of reperfusion. The peak of BCL-2 expression was at reperfusion 2 d.Conclusion PKC took place translocation activation during cerebral ischemia-reperfusion,PKC promoted the expression of FOS and BCL- 2. Their complex role influenced the neuronal apoptosis
, 百拇医药
【Key words】Cerebral ischemia-reperfusion Protein kinase C FOS BCL-2
蛋白激酶C(PKC)是一个富含丝/苏氨基酸的激酶，由77～23 KDa的多肽单链构成[1]，在脑缺血损伤的过程中充当第二信使的作用。蛋白FOS与BCL-2分别为原癌基因C-fos和bcl-2的蛋白产物，C-fos和bcl-2为原癌基因，与神经细胞的凋亡有重要关系。本研究利用大鼠脑缺血再灌注模型，观察不同时相点不同部位PKC活性的变化，以及FOS和BCL-2的表达情况，探讨PKC与FOS、BCL-2的关系， 以期对脑缺血再灌注损伤的机理作进一步的研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选择体重在280～320 g之间的健康雄性Wistar大鼠36只。动物来源于四川省中药研究所，动物共分为6组，分别是缺血前组，缺血30分钟再灌注1小时、6小时、1天、2天、4天组，共6组，每组6只动物。
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1.2 方法
1.2.1 模型制作 采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。
1.2.2 PKC活性测定 大鼠达到缺血再灌注时限后，快速断头取脑。在冰块上分离出右侧顶叶皮质、海马、纹状体。分别做成匀浆，经过两次超速低温离心分离出胞浆及胞膜PKC粗提物。 实验管分别加入酶、缓冲液、脂肪、水，对照管加入抑制剂而不加脂肪。在室温下孵育20分钟，以利PKC抑制剂和PKC充分结合。每个试管加入γ-32P/Substrate 10 μl 30℃孵育5分钟，将反应液25 μl移至碳酸纤维素纸片上。纸片用2%磷酸及蒸馏水冲洗各两次，然后放入烤箱内60℃烤干，放入闪烁瓶并加入闪烁液，室温平衡6小时后，行γ-闪烁计数。
样本蛋白含量测定：用紫外分光光度计，分别在280和260 mm处测光密度，根据公式(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数，算出样本蛋白量。
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PKC活性计算方法：PKC活性=(反应管Cpm-对照管Cpm) / 总计数Cpm×样品蛋白含量。
用1 μl的[γ-32P]-ATP做总计数Cpm测定
1.2.3 石蜡切片制作 大鼠达到缺血再灌注时限后，用100～200 ml生理盐水从左心室灌注，再用4%多聚甲醛灌注固定，迅速断头取脑，入4%多聚甲醛液中固定10～12小时，冠状切开脑组织，切开的组织块分别含有纹状体和海马结构，其厚度大约是5 mm，依次脱水、浸蜡、包埋、贴片，贴片后放入烤箱内37℃烤24～48小时，然后放入4℃冰箱内保存备用，切片厚度为5 μm。
1.2.4 BCL-2及C-FOS检查 采用免疫组化法。FOS检测步骤如下：切片依次脱蜡至水，双蒸水洗3×5分钟，入新鲜配制的10%H2O2甲醇液室温作用20分钟，0.1%胰蛋白酶消化切片20分钟，蒸馏水、PBS各洗3×5分钟，滴加1:75(C-FOS)单抗50 μl，37℃孵育2小时，PBS洗3×5分钟，滴加1∶75Ⅱ抗，37℃孵育1小时，PBS洗3×5分钟，滴加ABC复合物，37 ℃孵育30分钟，PBS洗2×5分钟，DAB染色。镜下控制反应，脱水、透明、封固。BCL-2检测的操作步骤与FOS相似，其中增加微波炉Ⅱ档作用10分钟。
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1.2.5 统计学处理 结果用(均数±标准差)表示。采用华西医科大学PEMS医用统计程序包，进行单因素方差分析及相关分析。
2 结 果
2.1 PKC活性变化 各个脑区胞膜PKC(PKCm)活性，缺血再灌注后逐渐升高，海马部分PKCm升高最为显著。相反胞液PKC活性(PKCc) 随着缺血再灌注时间的延长而逐渐下降。具体结果见表1及表2。
表1 脑缺血再灌注期间膜PKC活性的变化(
±s，pmol/min/mg protein)
Pre
IR1 h
IR6 h
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IR1 d
IR2 d
IR4 d
皮 质
0.66±0.06
2.03±0.09*
5.07±0.14*
5.55±0.17*
5.65±0.12*
5.97±0.26*
海 马
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0.37±0.03
2.10±0.09*
6.46±0.14*
7.12±0.21*
7.33±0.25*
7.60±0.17*
纹状体
0.64±0.05
1.93±0.16*
4.90±0.35*
, 百拇医药
5.04±0.33*
5.20±0.27*
5.25±0.22*
与对照组相比* P<0.01表2 脑缺血再灌注后胞液PKC活性的变化(±s,pmol/min/mg protein)
Pre
IR1 h
IR6 h
IR1 d
IR2 d
, 百拇医药
IR4 d
皮 质
2.24±0.09
2.06±0.06*
1.25±0.09*
0.97±0.13*
0.45±0.04*
0.42±0.04*
海 马
1.98±0.05
1.30±0.04*
, 百拇医药
1.09±0.05*
0.68±0.05*
0.31±0.03*
0.25±0.03*
纹壮体
2.30±0.10
2.06±0.09*
1.25±0.09*
1.02±0.07*
0.43±0.03*
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0.37±0.04*
与对照组相比* P<0.01
2.2 FOS表达 具体结果见表3。FOS阳性染色细胞呈棕黄色，位于胞核内。缺血再灌注6小时及1天时，FOS表达最多，随后逐渐减少。从空间分布看，海马区最多，皮质次之。纹状体含量最少。各时相点与对照组相比有显著差异(P<0.01)。
表3 脑缺血再灌注期间FOS的表达(±s)
Pre
IR1 h
IR6 h
IR1 d
, 百拇医药
IR2 d
IR4 d
皮 质
0.76±0.46
40.64±1.28*
49.44±1.46*
47.34±0.59*
41.52±1.50*
15.08±2.13*
海 马
0.96±0.18
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68.50±2.67*
77.02±7.66*
78.42±3.75*
71.86±1.83*
28.26±1.48*
纹状体
1.20±0.22
22.38±0.79*
37.60±1.44*
36.84±0.27*
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32.94±2.46*
12.14±1.91*
与对照组相比* P<0.01
2.3 BCL-2的表达 阳性染色主要位于核周，胞浆内的其它部位少见，在海马树突亦有少量染色，缺血再灌注后BCL-2表达明显增多，其高峰是缺血再灌注2天，空间分布与FOS相似，为海马最多，皮质次之，纹状体最少，见表4。
表4 脑缺血再灌注期间BCL-2的表达(±s)
Pre
IR1 h
, 百拇医药
IR6 h
IR1 d
IR2 d
IR4 d
皮 质
1.40±1.29
16.40±0.92
29.88±1.92*
47.10±6.39*
63.49±3.62*
26.54±1.84*
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海 马
1.76±0.32
16.40±3.07*
29.40±2.46*
65.16±1.53*
79.44±7.92*
32.20±2.44*
纹状体
0.52±0.47
4.22±1.34*
, 百拇医药
14.68±3.45*
30.62±1.39*
36.84±1.39*
16.58±1.72*
与对照组相比* P<0.01
3 讨论
PKC是一个富含丝/苏氨基酸的激酶，于1977年被Takai等[2]发现，PKC在信号传导过程中充当第二信使的作用，其具体的生理功能有促进神经递质的释放、突触塑形、细胞增生、基因表达等。近年来，它在细胞凋亡中的作用日益突出。
本实验发现在假手术对照组PKC活性降低，缺血再灌注组，膜PKC活性快速增加，缺血再灌注1天组增加最快，随着再灌注时间的延长，其活性的增加变得较为缓慢。从本实验还可以发现缺血易损的海马区PKCm活性增加最显著。胞液PKC活性的变化正相反，随着缺血再灌注时间的延长，其活性逐渐下降，这说明PKC 在脑缺血再灌注期间发生了易位激活。位于胞液中的PKC是无活性的,激活后易位于胞膜, 此为膜的易位激活[3]。有人证实在缺血脑组织,胞膜部分PKCr和PKC βⅡ分别增加391%和291%，胞浆中的PKC分别减少68%和64%， 表现出明显的从胞液到胞膜的易位[4]。
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早期即刻基因是一种在各种有害刺激条件下出现早、持续时间短的基因，C-FOS基因是其中之一种，基础转录较低，但可以被各种不同的第二信使分子引起快速而短暂地表达。C-FOS的蛋白产物是FOS，原癌基因C-Jun编码的蛋白是JUN，FOS含有一个亮氨酸抗链(Leucine Zipper LZ)[5]，FOS与JUN在细胞核内通过LZ结构形成异二聚体，称为转录因子AP-1，结合于靶基因的AP-1位点，作核的第三信使，能使效应基因较长时间的表达。
本研究发现，缺血再灌注1小时时，FOS表达明显增加，再灌注6小时达到高峰，再灌注1天和2天时仍有少量表达，表达最多的脑区是海马。国外也有类似的报告，Islam[6]发现缺血1小时病灶同侧皮质神经元表达增多，缺血3～6小时最多，缺血3天回到基线水平。
FOS的作用是促进了缺血脑组织神经细胞的凋亡[7]。BCL-2是BCL-2基因家族成员之一，BCL-2家族包括BCL-x，Bax，Mcl-1和Al，其中BCL-2作为抑制凋亡的基因，近年来研究较多。
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本实验发现BCL-2在缺血前组有少量表达， 缺血再灌注时快速升高，至再灌注2天时达最大值，此后略有下降。表达最多的部位依次是海马、顶叶皮质、纹状体。
从前也有人报告BCL-2在脑缺血中的表达情况。Cehn[8]利用免疫细胞化学技术和Westorn先进技术，在研究大鼠短暂性局部脑缺血时发现，在皮质及梗死的边缘区存在BCL-2蛋白的表达。
本实验发现PKC与FOS的表达有关(RH=0.830，RC=0.794，RS=0.785)，PKC促进了FOS的表达。陈康宁等[9]研究发现PKC 的激动剂PMA 可以引起培养神经元钙超载，而1989年Sonnenberg等[10]报告细胞内钙离子增多可诱导C-FOS表达，相反钙离子阻断剂可抑制之，因此我们可以推断PKC是通过钙引起FOS表达的。
本实验还发现PKC与BCL-2的表达有关(RH=0.742，RC=0.825,RS=0.796)。在人神经纤维瘤SH-SY5Y细胞[11]，BCL-2的表达受PKC和PKA的调节，PKC对BCL-2有正向调节作用，PKA的作用则相反。另外还有人证实PKC通过其它途径影响BCL-2。PKC是一个磷酸化蛋白，BCL-2一级结构有7个丝氨酸残基，PKC可使之磷酸化，从而活化了BCL-2，使之发挥抑制凋亡的作用[12]。
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有人发现PKCβ在细胞凋亡过程中与核膜的裂解有关[13]，说明PKC直接参与了细胞的凋亡，PKC是在信号传导过程中发挥作用的，PKC活化引起一系列下游事件，如FOS与BCL-2的表达，最终对神经细胞的影响，则是这几种因素综合作用的结果。
国家自然科学基金资助项目 批准号 No:39070269
参 考 文 献
1，Azzi Angelo,Oscoboinik Daniel,Hensey Carmel, et al. The protein kinase C family. FEBS,1992，208:547
2，Takai Y,Kishimoto A,Inoue M,et al.Studies on a cyctic neudotide independent protein kinase and its proenzyme in mammalian tissue.J Biol Chem 1997 ，152:7603
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3，Pongracz Judit,Peacon Eliabeth M，Tohnson Gerald D,et al. Doppa induces cell death but not differentiation of U937 cells:evidence for the involvement of PKCβI in the regulation of apoptosis. Leak Res,1996，40:319
4，Monika Cardell,Tadersz Wiilolch. Time course of the translocation and inhibition of protein kinase C during complete cerebral ischemia in the rat.J Neurochem, 1993，61:1308
5，Morgan J， Curuan T. Stimulus-transcription coupling in the neurons systemy involvement of the inclucible proto-oncogenes fos and jun.Annu Rev Neurosci,1991，14:421
, 百拇医药
6，Islam N.Detection of DNA damage induced by apoptosis in the rat brain:following incomplete ischemia.Neurosc Lett, 1995，188:159
7，Estus Staven,Zaks Willian J, Fleeman Kobeltc. Altered gene expression in neurons during programmed cell death identification of C-jun as necessary for neuronal apoptosis. J Cell Biol,1994，129:1717
8，Gu GZ,de Deigo T,Crespo D.Transient C-fos expression accompaies naturally occuring cell death in developing interhemispheric cortox of the rat.Dev Brain Res,1992，68:83
, 百拇医药
9，陈康宁，董为伟，张帆.蛋白激酶C激动剂PMA对培养神经元胞内游离钙的影响.第三军医大学学报,1997，19:408
10，Sonnenberg TL.Glutamate receptor agonists increase the expression of Fos,Fra,AP-1 RNA binding in the mammalian brain.J Neurosc Res, 1989，24:72
11，Yasahiro Itano,Akihiro Ito.Takaski Uehara, et al. Regulation of BCL-2 protein expression in human neurblastome SH-SY5Y cell;Positive and negative effects of protein kinase C and A, respectively. Journal of Neurochemistry,1996，67:131
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12，Takahiko Ito,Deng Xingning, Carr Bocyl, et al. Bcl- 2 phosphorylation reguired for anti apoptosis function.J Biol Chem,1997，272:11671
13，Pongraca J,Trffley W,Johnson GD, et al.Changes in protein kinase C isoenzyme associated with apoptosis in U937 myelomonlcytic cells. Exp Cell Res,1995，218:430
收稿1999-01-27 修回1999-06-28, 百拇医药
单位：李云峰(250031济南军区总医院神经内二科)；陈康宁 郑彩梅(第三军医大学西南医院神经内科)
关键词：脑缺血；再灌注；蛋白激酶C；FOS；BCL-2
临床神经病学杂志000101 【摘要】 目的 探讨大鼠脑缺血再灌注时蛋白激酶C(PKC)活性的变化与FOS、BCL-2表达的关系。方法 采用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，用磷基转移片检测PKC的活性，用免疫组化法检测BCL-2及FOS的含量。结果 缺血再灌注后膜PKC活性持续增加，FOS在缺血再灌注早期即有明显增加，至缺血再灌注2天时仍有少量表达。BCL-2表达的高峰是在缺血再灌注2天时。结论 缺血再灌注期间PKC发生易位激活，PKC促进了FOS和BCL-2的表达，这几个因素综合作用影响神经细胞凋亡。
PKC activity,FOS and BCL-2 expression after cerebral ischemia-reperfusion in rats
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Li Yunfeng,Chen Kangning,Zheng Caimei
(Department of Neurology, Jinan Military Gene-ral Hospital, Jinan 250031)
【Abstract】 Objective To research the relationship between the change of protein kinase C(PKC) activity and the expression of FOS, BCL-2 during cerebral ischemia-reperfusion.Methods Middle cerebral artery ischemia-reperfusion model was established in Wistar rats. In these regions the changes of PKC activity were measured by phosphoryl transfer pieces. The contents of BCL-2 and FOS were observed with immunohistochemistry.Results The PKC activity in membrane increased continuously after cerebral ischemia-reperfusion.FOS increased remarkably at early stage of reperfusion,there was a small amount expression till 2 d of reperfusion. The peak of BCL-2 expression was at reperfusion 2 d.Conclusion PKC took place translocation activation during cerebral ischemia-reperfusion,PKC promoted the expression of FOS and BCL- 2. Their complex role influenced the neuronal apoptosis
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【Key words】Cerebral ischemia-reperfusion Protein kinase C FOS BCL-2
蛋白激酶C(PKC)是一个富含丝/苏氨基酸的激酶，由77～23 KDa的多肽单链构成[1]，在脑缺血损伤的过程中充当第二信使的作用。蛋白FOS与BCL-2分别为原癌基因C-fos和bcl-2的蛋白产物，C-fos和bcl-2为原癌基因，与神经细胞的凋亡有重要关系。本研究利用大鼠脑缺血再灌注模型，观察不同时相点不同部位PKC活性的变化，以及FOS和BCL-2的表达情况，探讨PKC与FOS、BCL-2的关系， 以期对脑缺血再灌注损伤的机理作进一步的研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选择体重在280～320 g之间的健康雄性Wistar大鼠36只。动物来源于四川省中药研究所，动物共分为6组，分别是缺血前组，缺血30分钟再灌注1小时、6小时、1天、2天、4天组，共6组，每组6只动物。
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1.2 方法
1.2.1 模型制作 采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。
1.2.2 PKC活性测定 大鼠达到缺血再灌注时限后，快速断头取脑。在冰块上分离出右侧顶叶皮质、海马、纹状体。分别做成匀浆，经过两次超速低温离心分离出胞浆及胞膜PKC粗提物。 实验管分别加入酶、缓冲液、脂肪、水，对照管加入抑制剂而不加脂肪。在室温下孵育20分钟，以利PKC抑制剂和PKC充分结合。每个试管加入γ-32P/Substrate 10 μl 30℃孵育5分钟，将反应液25 μl移至碳酸纤维素纸片上。纸片用2%磷酸及蒸馏水冲洗各两次，然后放入烤箱内60℃烤干，放入闪烁瓶并加入闪烁液，室温平衡6小时后，行γ-闪烁计数。
样本蛋白含量测定：用紫外分光光度计，分别在280和260 mm处测光密度，根据公式(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数，算出样本蛋白量。
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PKC活性计算方法：PKC活性=(反应管Cpm-对照管Cpm) / 总计数Cpm×样品蛋白含量。
用1 μl的[γ-32P]-ATP做总计数Cpm测定
1.2.3 石蜡切片制作 大鼠达到缺血再灌注时限后，用100～200 ml生理盐水从左心室灌注，再用4%多聚甲醛灌注固定，迅速断头取脑，入4%多聚甲醛液中固定10～12小时，冠状切开脑组织，切开的组织块分别含有纹状体和海马结构，其厚度大约是5 mm，依次脱水、浸蜡、包埋、贴片，贴片后放入烤箱内37℃烤24～48小时，然后放入4℃冰箱内保存备用，切片厚度为5 μm。
1.2.4 BCL-2及C-FOS检查 采用免疫组化法。FOS检测步骤如下：切片依次脱蜡至水，双蒸水洗3×5分钟，入新鲜配制的10%H2O2甲醇液室温作用20分钟，0.1%胰蛋白酶消化切片20分钟，蒸馏水、PBS各洗3×5分钟，滴加1:75(C-FOS)单抗50 μl，37℃孵育2小时，PBS洗3×5分钟，滴加1∶75Ⅱ抗，37℃孵育1小时，PBS洗3×5分钟，滴加ABC复合物，37 ℃孵育30分钟，PBS洗2×5分钟，DAB染色。镜下控制反应，脱水、透明、封固。BCL-2检测的操作步骤与FOS相似，其中增加微波炉Ⅱ档作用10分钟。
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1.2.5 统计学处理 结果用(均数±标准差)表示。采用华西医科大学PEMS医用统计程序包，进行单因素方差分析及相关分析。
2 结 果
2.1 PKC活性变化 各个脑区胞膜PKC(PKCm)活性，缺血再灌注后逐渐升高，海马部分PKCm升高最为显著。相反胞液PKC活性(PKCc) 随着缺血再灌注时间的延长而逐渐下降。具体结果见表1及表2。
表1 脑缺血再灌注期间膜PKC活性的变化(
±s，pmol/min/mg protein)Pre
IR1 h
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皮 质
0.66±0.06
2.03±0.09*
5.07±0.14*
5.55±0.17*
5.65±0.12*
5.97±0.26*
海 马
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0.37±0.03
2.10±0.09*
6.46±0.14*
7.12±0.21*
7.33±0.25*
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纹状体
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4.90±0.35*
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与对照组相比* P<0.01表2 脑缺血再灌注后胞液PKC活性的变化(
±s,pmol/min/mg protein)Pre
IR1 h
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2.24±0.09
2.06±0.06*
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与对照组相比* P<0.01
2.2 FOS表达 具体结果见表3。FOS阳性染色细胞呈棕黄色，位于胞核内。缺血再灌注6小时及1天时，FOS表达最多，随后逐渐减少。从空间分布看，海马区最多，皮质次之。纹状体含量最少。各时相点与对照组相比有显著差异(P<0.01)。
表3 脑缺血再灌注期间FOS的表达(
±s)Pre
IR1 h
IR6 h
IR1 d
, 百拇医药
IR2 d
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皮 质
0.76±0.46
40.64±1.28*
49.44±1.46*
47.34±0.59*
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海 马
0.96±0.18
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68.50±2.67*
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78.42±3.75*
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32.94±2.46*
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与对照组相比* P<0.01
2.3 BCL-2的表达 阳性染色主要位于核周，胞浆内的其它部位少见，在海马树突亦有少量染色，缺血再灌注后BCL-2表达明显增多，其高峰是缺血再灌注2天，空间分布与FOS相似，为海马最多，皮质次之，纹状体最少，见表4。
表4 脑缺血再灌注期间BCL-2的表达(
±s)Pre
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IR4 d
皮 质
1.40±1.29
16.40±0.92
29.88±1.92*
47.10±6.39*
63.49±3.62*
26.54±1.84*
, 百拇医药
海 马
1.76±0.32
16.40±3.07*
29.40±2.46*
65.16±1.53*
79.44±7.92*
32.20±2.44*
纹状体
0.52±0.47
4.22±1.34*
, 百拇医药
14.68±3.45*
30.62±1.39*
36.84±1.39*
16.58±1.72*
与对照组相比* P<0.01
3 讨论
PKC是一个富含丝/苏氨基酸的激酶，于1977年被Takai等[2]发现，PKC在信号传导过程中充当第二信使的作用，其具体的生理功能有促进神经递质的释放、突触塑形、细胞增生、基因表达等。近年来，它在细胞凋亡中的作用日益突出。
本实验发现在假手术对照组PKC活性降低，缺血再灌注组，膜PKC活性快速增加，缺血再灌注1天组增加最快，随着再灌注时间的延长，其活性的增加变得较为缓慢。从本实验还可以发现缺血易损的海马区PKCm活性增加最显著。胞液PKC活性的变化正相反，随着缺血再灌注时间的延长，其活性逐渐下降，这说明PKC 在脑缺血再灌注期间发生了易位激活。位于胞液中的PKC是无活性的,激活后易位于胞膜, 此为膜的易位激活[3]。有人证实在缺血脑组织,胞膜部分PKCr和PKC βⅡ分别增加391%和291%，胞浆中的PKC分别减少68%和64%， 表现出明显的从胞液到胞膜的易位[4]。
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早期即刻基因是一种在各种有害刺激条件下出现早、持续时间短的基因，C-FOS基因是其中之一种，基础转录较低，但可以被各种不同的第二信使分子引起快速而短暂地表达。C-FOS的蛋白产物是FOS，原癌基因C-Jun编码的蛋白是JUN，FOS含有一个亮氨酸抗链(Leucine Zipper LZ)[5]，FOS与JUN在细胞核内通过LZ结构形成异二聚体，称为转录因子AP-1，结合于靶基因的AP-1位点，作核的第三信使，能使效应基因较长时间的表达。
本研究发现，缺血再灌注1小时时，FOS表达明显增加，再灌注6小时达到高峰，再灌注1天和2天时仍有少量表达，表达最多的脑区是海马。国外也有类似的报告，Islam[6]发现缺血1小时病灶同侧皮质神经元表达增多，缺血3～6小时最多，缺血3天回到基线水平。
FOS的作用是促进了缺血脑组织神经细胞的凋亡[7]。BCL-2是BCL-2基因家族成员之一，BCL-2家族包括BCL-x，Bax，Mcl-1和Al，其中BCL-2作为抑制凋亡的基因，近年来研究较多。
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本实验发现BCL-2在缺血前组有少量表达， 缺血再灌注时快速升高，至再灌注2天时达最大值，此后略有下降。表达最多的部位依次是海马、顶叶皮质、纹状体。
从前也有人报告BCL-2在脑缺血中的表达情况。Cehn[8]利用免疫细胞化学技术和Westorn先进技术，在研究大鼠短暂性局部脑缺血时发现，在皮质及梗死的边缘区存在BCL-2蛋白的表达。
本实验发现PKC与FOS的表达有关(RH=0.830，RC=0.794，RS=0.785)，PKC促进了FOS的表达。陈康宁等[9]研究发现PKC 的激动剂PMA 可以引起培养神经元钙超载，而1989年Sonnenberg等[10]报告细胞内钙离子增多可诱导C-FOS表达，相反钙离子阻断剂可抑制之，因此我们可以推断PKC是通过钙引起FOS表达的。
本实验还发现PKC与BCL-2的表达有关(RH=0.742，RC=0.825,RS=0.796)。在人神经纤维瘤SH-SY5Y细胞[11]，BCL-2的表达受PKC和PKA的调节，PKC对BCL-2有正向调节作用，PKA的作用则相反。另外还有人证实PKC通过其它途径影响BCL-2。PKC是一个磷酸化蛋白，BCL-2一级结构有7个丝氨酸残基，PKC可使之磷酸化，从而活化了BCL-2，使之发挥抑制凋亡的作用[12]。
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有人发现PKCβ在细胞凋亡过程中与核膜的裂解有关[13]，说明PKC直接参与了细胞的凋亡，PKC是在信号传导过程中发挥作用的，PKC活化引起一系列下游事件，如FOS与BCL-2的表达，最终对神经细胞的影响，则是这几种因素综合作用的结果。
国家自然科学基金资助项目 批准号 No:39070269
参 考 文 献
1，Azzi Angelo,Oscoboinik Daniel,Hensey Carmel, et al. The protein kinase C family. FEBS,1992，208:547
2，Takai Y,Kishimoto A,Inoue M,et al.Studies on a cyctic neudotide independent protein kinase and its proenzyme in mammalian tissue.J Biol Chem 1997 ，152:7603
, http://www.100md.com
3，Pongracz Judit,Peacon Eliabeth M，Tohnson Gerald D,et al. Doppa induces cell death but not differentiation of U937 cells:evidence for the involvement of PKCβI in the regulation of apoptosis. Leak Res,1996，40:319
4，Monika Cardell,Tadersz Wiilolch. Time course of the translocation and inhibition of protein kinase C during complete cerebral ischemia in the rat.J Neurochem, 1993，61:1308
5，Morgan J， Curuan T. Stimulus-transcription coupling in the neurons systemy involvement of the inclucible proto-oncogenes fos and jun.Annu Rev Neurosci,1991，14:421
, 百拇医药
6，Islam N.Detection of DNA damage induced by apoptosis in the rat brain:following incomplete ischemia.Neurosc Lett, 1995，188:159
7，Estus Staven,Zaks Willian J, Fleeman Kobeltc. Altered gene expression in neurons during programmed cell death identification of C-jun as necessary for neuronal apoptosis. J Cell Biol,1994，129:1717
8，Gu GZ,de Deigo T,Crespo D.Transient C-fos expression accompaies naturally occuring cell death in developing interhemispheric cortox of the rat.Dev Brain Res,1992，68:83
, 百拇医药
9，陈康宁，董为伟，张帆.蛋白激酶C激动剂PMA对培养神经元胞内游离钙的影响.第三军医大学学报,1997，19:408
10，Sonnenberg TL.Glutamate receptor agonists increase the expression of Fos,Fra,AP-1 RNA binding in the mammalian brain.J Neurosc Res, 1989，24:72
11，Yasahiro Itano,Akihiro Ito.Takaski Uehara, et al. Regulation of BCL-2 protein expression in human neurblastome SH-SY5Y cell;Positive and negative effects of protein kinase C and A, respectively. Journal of Neurochemistry,1996，67:131
, http://www.100md.com
12，Takahiko Ito,Deng Xingning, Carr Bocyl, et al. Bcl- 2 phosphorylation reguired for anti apoptosis function.J Biol Chem,1997，272:11671
13，Pongraca J,Trffley W,Johnson GD, et al.Changes in protein kinase C isoenzyme associated with apoptosis in U937 myelomonlcytic cells. Exp Cell Res,1995，218:430
收稿1999-01-27 修回1999-06-28, 百拇医药