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编号:10229157
电脉冲介导红细胞生成素基因肌肉转移治疗大鼠肾性贫血
http://www.100md.com 《中国医学杂志》 2000年第3期
     作者:陆小春 周爱儒 牛大地 金彩科 陈光慧 朱小君 汤健

    单位:陆小春 周爱儒 牛大地(北京医科大学生化与分子生物学系 100083);金彩科 陈光慧 朱小君 汤健(北京医科大学心血管基础研究所)

    关键词:贫血;红细胞生成素;基因疗法

    中华医学杂志000327 摘 要:目的 研究电脉冲介导的质粒红细胞生成素(EPO)基因肌肉转移效率以及对肾性贫血的治疗作用。方法 用腺嘌呤诱导大鼠慢性肾性贫血模型,以电脉冲介导质粒EPO基因肌肉转移对60只大鼠实施基因治疗(电脉冲实验组),治疗期间监测血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)和血清肌酐(Cr)、血清尿素氮(BUN),并用EPO酶联免疫(ELISA)试剂盒测定血清EPO水平,逆转录聚合酶链反应(RT/PCR)检测EPO基因局部表达情况。结果 电脉冲介导的EPO基因肌肉转移可在局部有效表达和分泌,并在3周内使Hb和HCT分别提高46.5%和43%(Hb:84 g/L±12 g/L,122 g/L±28 g/L;HCT:26%±5%,38%±9%)。5周Hb和HCT分别上升至正常水平的91.2%和86.5%(Hb:126 g/L±32 g/L,正常水平:139 g/L±10 g/L;HCT:40%±11%,正常水平:46%±2.2%)并维持高水平至少9周。动物9周存活率(77.8%)是对照组(16.7%)的4倍,同时电脉冲实验组其Hb、HCT、EPO均显著高于非电脉冲实验组,并呈现一定的剂量效应。结论 电脉冲介导的质粒EPO基因肌肉转移能使EPO基因局部显著表达和分泌,对肾性贫血有较好的治疗作用,该方法具有很好的临床应用前景。
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    The effects of electroporation-mediated erythropoietin (EPO) gene transfer into skeleton muscle on renal anemia

    LU Xiaochun ZHOU Airu JIN Caike, et al.

    (Department of Biochemistry, Beijing Medical University, Beijing 100083, China)

    Abstract:Objective To investigate the effects of erythropoietin (EPO) gene transfer into skeleton muscle mediated by electroporation on renal anemia. Methods Renal failure models were created by adenine-excessive diet (150 mg per day). Plasmid vectors encoding EPO were transferred by electroporation after 80 days when mean blood urea nitrogen level (BUN) had increased from 3.4 mmol/L±1.3 mmol/L to 18.1 mmol/L±4.1 mmol/L and the hematocrit had decreased from 45.6%±2.1% to 25.4%± 3.7%. During the process of treatment, adenine-excessive diet was given. Hb, HCT, BUN and Cre in blood were tested by automatic analyzer; EPO level in the serum was tested by EPO ELISA kit, EPO gene expression was proved by RT/PCR.The survival rate was caculated. Results Hematocrit increased to 34.4%±7.5% only 7 days after the treatment and reached 91.4% of normal level (46%±2%) after 5 weeks. The survival rate of test models after 9 weeks was 77.8%, which was remarkably higher than that of controls (16.7%). mRNA level of EPO gene expression was indicated by RT/PCR. Conclusion Electroporation can increase the efficiency of EPO gene transfer and thus greatly improve hematocrit in mice and prolong the life-span of chronic renal anemia models. This method can provide a new way for treatment of EPO-responsive anemias.
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    Key words:Erythropoietin; Renal anemia; Gene therapy

    肾性贫血主要是由于肾脏产生红细胞生成素(EPO)不足而引起。近年来,以腺病毒、逆转录病毒、腺病毒相关载体及质粒为载体的EPO基因治疗研究均显示,体内导入EPO基因可以使红细胞压积(HCT)和血红蛋白(Hb)稳定升高并长时间维持[1-4]。质粒由于具有较好的安全性而被认为具有较好的应用前景[5],但是质粒载体基因转移效率低,很难达到较好的治疗效果,如何提高质粒载体基因转移效率是其应用于临床的关键。我们试用pcD2/EPO质粒直接注射于腺嘌呤诱导的肾性贫血大鼠模型的肌肉内,并在注射部位进行电脉冲刺激,以探讨电脉冲介导的质粒EPO基因治疗的基因转移效率及其治疗效果,为临床应用奠定基础。

    材料与方法

    一、材料
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    1.实验动物:Waster大鼠60只,体重150~180 g,购自北京医科大学实验动物部。

    2.腺嘌呤粉:饲料级,含量93%~95%,购自华美生物工程公司。

    3.肾性贫血动物模型的制备:根据文献[6]将腺嘌呤粉以0.4%的比例加入普通大鼠饲料中,加工成块料。实验动物随机分成2组,实验组喂0.4%的腺嘌呤饲料;对照组喂普通饲料。所有动物常规饲养,每隔20天尾静脉采血,以自动化仪分别测定血常规Hb、HCT和肾功能(血清尿素氮BUN;血清肌酐等)。

    4.pcD2/EPO:由本室构建,含巨细胞病毒启动子和PolyA尾,大小6.2 kb,结构见图1。

    图1 pcD2/EPO模式图
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    5.质粒提取和鉴定:Luria-Bertani培养基常规培养扩增工程菌,以碱裂解法提取质粒,经聚乙二醇纯化后测定A260/A280,以0.8%琼脂糖凝胶电泳酶切鉴定,鉴定图谱见图2。

    1.酶切质粒 2.pcD2/EPO

    图2 pcD2/EPO酶切鉴定图

    6.质粒应用液的配制:将纯化和鉴定以后的质粒配制成1 mg/ml的5%葡萄糖溶液。

    7.电脉冲仪:北京医科大学生理教研室研制。

    二、方法

    1.动物模型的预处理:将所有的贫血模型于治疗前3天分别在大鼠2条后腿的两侧共4个部位用15%的硫代硫酸钠脱毛1 cm×1 cm,在其脱毛部位肌肉内纵向浸润注射0.5%丁哌卡因100 μl。
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    2.电脉冲介导的EPO基因转移:经预处理的动物模型随机分为5组(对照1、2组、实验3、4、5组)。在注射丁哌卡因的每个部位,实验5组分别注射pcD2/EPO 100 μl(1 μg/μl);实验3、4组分别注射pcD2/EPO 50 μl(1 μg/1 μl);对照组分别注射pcD2空载质粒100 μl(1 μg/1 μl)。实验1、4、5组在注射质粒的部位插入两根长0.5 cm,直径0.5 mm的不锈钢针式电极,插入深度与方向与注射质粒时一致,使质粒处在两电极之间。调节电脉冲仪的电压为80 V,波幅1 ms,频率为1次/秒,打开电源刺激4次,将电极反向,再刺激4次。

    3.治疗期间血液指标监测:所有动物继续喂以0.4%腺嘌呤饲料,每周尾静脉采血,自动化分析仪分别测定Hb,HCT和尿素氮BUN,血清肌酐等。于2、4、6周测定血清EPO水平(德国产EPO ELISA试剂盒)。

    4.局部表达观察:取第1、7、14和21 d注射部位肌肉一步法提取总RNA,RT/PCR检测pcD2/EPO表达情况。上游引物序列为5′CGGATCCGCGGA-GATGGGGTGCACG-3′,下游引物为5′GGTCATTC-TGTCCCCTGTCCTGC-3′。
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    5.治疗期动物存活状态观察:治疗期间每隔2周统计动物存活率。

    6.统计学方法:采用t检验,方差分析和多重比较的s检验。数据用均数±标准差表示。

    结果

    1.肾性贫血大鼠模型的制作:以0.4%腺嘌呤饲养大鼠20 d即有明显的血常规和肾功能变化,80 d时对照组和模型组大鼠血清BUN分别为3.4 mmol/L±1.3 mmol/L;18.1 mmol/L±4.1 mmol/L。肌酐分别为:79 μmol/L±16 μmol/L;284 μmol/L±44 μmol/L)。Hb和HCT分别下降41%(Hb:139 g/L±10 g/L、82 g/L±12 g/L)和45.7%(HCT:46%±2%、25%±4%),模型呈中度贫血状态。

    2.EPO基因治疗期贫血模型血常规变化:电脉冲实验组4(注射200 μg pcD2EPO每只模型)和实验组5(注射400 μg pcD2EPO每只模型)的Hb在治疗1周后即分别上升至102 g/L和108 g/L,达到正常水平的下限;3周时实验组5上升至126 g/L,接近正常水平平均值139 g/L,与同期对照组(76 g/L)相比上升幅度为83.8%(图3)。
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    图3 EPO基因治疗期大鼠红细胞压积的变化

    3.EPO基因治疗期肾功能变化:3周时与对照组相比BUN(17.4 mmol/L±4.0 mmol/L;20.3 mmol/L±2.6 mmol/L;P>0.05)和肌酐(245 μmol/L±40 μmol/L; 258 μmol/L±39 μmol/L;P>0.05)的变化差异无显著意义。

    4.治疗期贫血模型存活率:5周时电脉冲实验组3、4的存活率分别为77.8%和60%,与对照组(16.7%)差异有显著意义。

    5.电脉冲介导与直接注射组治疗效果的比较:多重比较的s检验显示,电脉冲实验4、5组在5周时的Hb分别为110 g/L±19 g/L和126 g/L±32 g/L,与实验3组(直接注射组)(78 g/L±16 g/L)和对照组之间差异有显著性意义(P<0.05)(图3)。
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    6.EPO的局部表达与分泌:pcD2/EPO剂量组与对照组的血清EPO的ELISA测定结果(图4)和注射局部肌肉EPO基因mRNA的 RT/pcR显示电脉冲实验组的EPO基因显著表达;差异有显著意义(实验组4第14 d时血清EPO为:30 nu/nl±6 nu/nl;对照组10 nu/nl±5 nu/nl;P<0.01)。

    图4 EPO基因治疗大鼠血清EPO水平

    讨论

    腺嘌呤诱导肾性贫血的机理在于体内过量的腺嘌呤分解代谢使尿酸过饱和而在肾脏形成结晶,导致慢性肾功能衰竭,引起肾性贫血[7]。从基因治疗的结果来看,模型的贫血是由于EPO不足而引起。与肾切除法相比,腺嘌呤诱导的肾性贫血模型具有易操作,稳定以及更接近人慢性肾衰的特点。
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    据报道,电脉冲在体外可以有效实行基因转移[8]。体内电脉冲介导的白细胞介素(IL-5)基因转移可以使血清IL-5的水平比非电脉冲介导的基因转移提高200倍[9]。pcD2/VEGF基因肌肉直接注射治疗闭塞性血管病的研究已进入临床应用阶段[10,11],但是目前的质粒载体基因转移效率不高,对于需要提高基因表达产物血清水平的基因治疗在临床上一般较难达到理想的治疗效果。我们采用电脉冲介导实施质粒EPO的肌肉内基因转移,在国内外尚属首次。结果证明,该方法导入的EPO基因可以有效地表达与分泌,对由于肾功能衰竭引起的贫血有较好的治疗作用,可以在短时间内使HCT显著上升,5周可以达到正常水平。由于在慢性肾功能衰竭所致的肾性贫血中,贫血的原因除主要为EPO不足外,还有红细胞寿命缩短和失血等原因。因此在治疗过程中,没有肾功能的纠正可能会影响到HCT和Hb的上升幅度。我们在治疗过程中继续喂以腺嘌呤饲料,对照组HCT和Hb持续下降,与对照组的差距不断扩大。以对照组为参照,35 d时治疗组HCT和Hb分别上升91.3%和83.8%,说明EPO基因具有显著升高HCT和Hb的作用。EPO的ELISA结果显示EPO明显表达,但血清水平不高,同时在第3周后开始下降,说明在基因治疗中由于是一个持续的给药系统,因此可能并不需要达到应用重组EPO治疗时的血清EPO水平,这是基因治疗的一个优点。电脉冲介导的基因转移其治疗效果明显优于非电脉冲组,说明电脉冲可以提高基因转移效率。实施电脉冲介导的基因治疗后动物的存活率显著提高,说明纠正贫血状态后可延长大鼠的存活期,这在慢性肾功能衰竭的治疗中有十分重要的意义。在治疗过程中肾功能没有明显改善,因此纠正贫血对肾功能会不会有影响还有待于进一步研究。
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    目前EPO基因治疗主要采用病毒为载体,但是病毒载体目前还存在诸如安全性等问题,用质粒作为基因治疗载体对肾性贫血实施基因治疗其安全性比用病毒载体要好得多。我们将电脉冲方式用表面电极取代,亦取得了较好的效果,为基因治疗的应用研究提供了一条新的安全高效的途径。

    参考文献:

    1 Descamps V, Blumenfeld N, Villeval JL, et al. Erythropoietin gene transfer and expression in adult normal mice;Use of an adenovirus vector.Hum Gene Ther,1994,5:8979-8985.

    2 Villeval JL, Aouyer-Fe ssard P, Blumenfeld N, et al. Retrovirus-mediated transfer of the erythropoietin gene in hematopoietic cells improve the erythrocyte phenotype in murine beta-thalassemia. Blood, 1994,84:928-933.
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    3 Descamps V, Blumenfeld N, Benzard Y, et al. Keratinocytes as a target for gene therapy. Sustained production of erythropoietin in mice by human keratinocytes transduced with an adenoassociated virus vector.Arch Dermatol,1996,132:1207-1211.

    4 Tripathy SK, Svensson EC, Black HB, et al. Long-term expression of erythropoietin in the systemic circulation of mice after intramuscular injection of a plasmid DNA vector. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:10876-10880.
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    5 汤健,秦阳君,陈光慧.肌肉介导的基因转移DNA药物及其在心血管疾病中的应用.中华医学杂志,1997,77:798-780.

    6 刘永学,贺福初.腺嘌呤诱发大鼠肾性贫血模型的特点及鉴定.中华肾脏病杂志,1998,14:53-54.

    7 周小舟,张盛光. 腺嘌呤所致大鼠慢性肾衰的机理研究.基础医学与临床,1997,17:54-57.

    8 陈雪妮,蔡英林,李彬,等.用电击孔法转染人EPO基因以及在COS-7中的表达.中国应用生理学杂志,1991,7:316-317.

    9 Aihara H, Mlyazaki J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnol, 1998,16:867-870.

    10 郑卫,邢德志,周爱儒,等.血管内皮生长因子治疗狗闭塞性血管病的实验研究. 中华心血管病杂志,1998,8:26

    11 盛琴慧,朱国英,周爱儒,等.血管内皮生长因子治疗肢体动脉梗塞病的实验研究. 中华医学杂志,1999,79:129-132.

    收稿日期:1999-05-17, http://www.100md.com