瘤内注射核素标记混合抗体治疗肝癌的实验研究
作者：李仲宏 麦国丰 罗荣城 李爱民
单位：李仲宏(江门市人民医院，广东 江门 529000)；麦国丰(江门市人民医院，广东 江门 529000)；罗荣城(第一军医大学南方医院肿瘤科，广东 广州510515)；李爱民(第一军医大学南方医院肿瘤科，广东 广州510515)
关键词：肝肿瘤；放射免疫治疗；单克隆抗体；瘤内注射
第一军医大学学报000407 摘要：目的 为临床应用混合抗体进行瘤内注射放射免疫治疗提供实验依据。方法 在裸鼠荷人肝癌2.2.15移植瘤生长至1 cm时，瘤内分别或同时注射131I标记的抗癌胚蛋白(AFP)单克隆抗体(131I AFP-IT)和131I标记抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体S102(131I- S102-IT)，治疗后行SPECT显像观察标记抗体在肿瘤内的浓聚，并进行疗效观察。 结果 发现两种标记抗体联合治疗组肿瘤抑制率为76.5%，明显高于131I AFP-IT组的53.1%及131I- S102-IT组的47.3%，抗体在肿瘤内的浓聚也明显高于单独应用组。结论 多种抗体混合应用瘤内注射放射免疫治疗可增加标记抗体在肿瘤内的浓聚，并能提高放射免疫治疗的疗效。
, http://www.100md.com
中图分类号：R332; R457.2; R735.7 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0327-02
Experimental studies of treatment of the liver cancer by intratumoral injection of 131I-labeled multiple monoclonal antibodies
LI Zhong-hong, MAI Guo-feng
(Jiangmen People’s Hospital of Guangdong, Jiangmen 529000, China)
LUO Rong-cheng,LI Ai-min
, http://www.100md.com
(Department of Oncology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract：Objective To provide experimental basis for radioimmunotherapy of tumors by intratumoral infection of 131I-labeled multiple monoclonal antibodies. Methods Nude mice bearing subcutaneous human liver carcer xenografts were treated by intratumoral injection of 131I-labeled anti-AFP (a-fetoprotein) monoclonal antibody (131I-AFP) and/or 131I-labeled anti-HbsAg monoclonal antibody S102 (131I- S102). The alteration of the tumor size was observed and the radioactivity concentrations in the tumor, liver, blood and kidney were measured. Result It was found that the inhibition rate of the tumor in the group treated with 131I- AFP and 131I- S102 (76.5%) was higher than that in the group treated with 131I- S102 (47.3%) or 131I- AFP (53.1%) alone. The radioactivity concentration ratio of tumor to normal tissue (T/NT) in the group treated with 131I-AFP and 131I- S102 was higher than that in the group treated with 131I- S102 or 131I- AFP alone. Conclusion Intratumoral injection of 131I-labeled multiple monoclonal antibodies can increase the concentration of 131I-labeled monoclonal antibodies in tumor and enhance the efficacy of the radioimmunotherapy .
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Key words：liver neoplasms; radioimmunotherapy; monoantibody; intratumoral injection
肿瘤放射免疫治疗是以单抗为载体，将放射性核素导向肿瘤区，对肿瘤进行内照射。由于肿瘤细胞的异质性及肿瘤抗原调变等因素的影响，细胞表达抗原有很大的差异，单独应用某种抗体进行导向治疗往往难以达到满意的治疗效果。目前国内外应用混合抗体进行放射免疫治疗的研究很少，而应用混合抗体瘤内注射法进行放射免疫治疗尚未见有报道。为了探讨多种抗体联合应用对放射免疫治疗疗效的影响，我们采用了131I-AFP及131I-S102同时瘤内注射的方法，对裸鼠荷人肝癌移植瘤进行治疗，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
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抗AFP抗体及抗HbsAg单克隆抗体S102均由第一军医大学南方医院肿瘤科实验室研制，131I购自原子能研究设计院第一研究所。
1.2 抗体标记
采用Iodogen法进行单抗AFP及S102的131I标记，标记率及放化纯度分别为48.7%、99.3%和51.6%、99.5%，比放射活度分别为1 480 MBq.10 mg-1.ml-1及1 500 MBq.10 mg-1.ml-1。
1.3 实验动物模型
6周龄雄性裸小鼠(BALB/c)由第一军医大学实验动物中心提供。在右背部皮下接种人肝癌细胞株2.2.15，1×107/鼠，2～3周后肿瘤长径在1 cm左右时注射药物。
, 百拇医药
1.4 实验分组
分4组进行实验，每组取荷瘤裸鼠6只，比放射活度均为14.8 MBq。第1组，瘤内注射131I-AFP 10 μl；第2组，瘤内注射131I-S102 10 μl；第3组，瘤内注射131I-AFP 5 μl及131I-S102 5 μl；第4组，瘤内注射生理盐水10 μl。
1.5 SPECT显像
瘤内注射药物5 d后，将荷瘤裸鼠麻醉后进行SPECT显像，观察标记抗体在裸鼠体内的分布情况。
1.6 疗效观察
注射药物后每天观察裸鼠的生长、生活情况，每周测量肿瘤的长径、短径，按下列公式计算移植瘤体积及移植瘤生长抑制率[1]：
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移植瘤体积=(长径×短径2)/2移植瘤生长抑制率=(对照组体积-实验组体积)/对照组体积×100%
2 结果
2.1 标记抗体体内分布
由表1可见，瘤内注射5 d后，两种标记抗体混合应用组比放射性活度瘤/非瘤值(T/NT)明显大于131I-S102-IT或131I-AFP-IT组，P<0.05。说明两种抗体混合应用有利于标记抗体在肿瘤内浓聚。
表1 肿瘤与正常组织放射性活度比(n=6,
±s, T/NT)
Tab.1 Radioactivity concentration ratio of the tumor to normal tissue
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( n=6，Mean±SD, T/NT)
Group
Tumor/Blood
Tumor/Liver
Tumor/Kidney
131I-S102-ITI-S102-IT
5.36±0.76
2.18±0.61
3.19±0.51
131I-AFP-ITI-AFP-IT
, 百拇医药
4.15±0.54
2.37±0.42
3.42±0.66
Combination
7.93±1.24
3.84±0.55
6.06±1.09
2.2 肿瘤抑制率
由表2可见，131I-S102 和131I-AFP 混合组肿瘤抑制率为76.5%，明显高于131I-S102-IT 组的47.3%及131I-AFP-IT 组的53.1%，P<0.05。说明两种标记抗体混合应用具有协同作用，可提高肿瘤的治疗效果。
, 百拇医药
表2 放射免疫疗效观察(n=6,±s)
Tab.2 Curative effects of radioimmunotherapy ( n=6，Mean±SD)
Group
Tumor size (cm3)
Inhibition rate (%)
Before
After 3 weeks
Control
0.49±0.12
, 百拇医药
2.26±0.39
-
131I- S102 ITI- S102 IT
0.50±0.12
1.19±0.17
47.3
131I-AFP -ITI-AFP -IT
0.51±0.11
1.06±0.31
53.1
, http://www.100md.com
Combination
0.50±0.17
0.53±0.26
76.5
3 讨论
肝癌的放射免疫治疗中存在以下几个问题[1～3]，(1)血液稀释、肿瘤血管屏障、抗体穿透性差等因素的影响使标记抗体最终到达肿瘤内的剂量太小，难以达到根治剂量；(2)标记抗体杀伤力弱；(3)肿瘤抗原表达存在明显的差异。针对上述问题，我们进行了放射性核素标记混合抗体导向治疗肝癌的实验研究，发现可明显提高治疗效果。瘤内注射后，核素标记单克隆抗体不需要经过血液循环，直接进入肿瘤组织，并在肿瘤组织内扩散，可明显增加标记抗体在肿瘤内的浓聚，增强肿瘤细胞受照射的剂量，使更多的肿瘤细胞被杀伤，提高肝癌的导向治疗效果[4、5]。
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核素标记抗肿瘤单克隆抗体对肿瘤细胞的杀伤范围在几个细胞直径以内，且需要与肿瘤细胞表面相关抗原结合，经细胞的内吞作用，使标记抗体进入细胞内，对核内DNA进行短距离的照射，达到肿瘤治疗作用。因此，如何提高核素标记抗体与肿瘤细胞的结合剂量，是提高放射免疫治疗疗效必须解决的问题。而肿瘤细胞的抗原表达具有异质性，同一块肿瘤组织有多种抗原性，甚至同一肿瘤不同肿瘤细胞或细胞亚群间的抗原性也不一样，因此在不同肝癌或同一肝癌的不同细胞亚群之间，癌细胞的抗原表达都不同，并且由于抗原调变的存在，同一肿瘤细胞不同时期表达的抗原也不一样[6]。单独应用某一抗体进行导向治疗时，由于抗原异质性及抗原调变的影响，不表达相应抗原的肿瘤细胞不能与核素标记抗体结合。我们采用混合抗体作为导向载体，将不同的核素标记抗体直接注入肿瘤内，发现可明显提高肿瘤的治疗效果，其原因可能是核素标记混合抗体瘤内注射后，不同的抗体可与不同的肿瘤相关抗原结合，使表达不同抗原的肿瘤细胞均能结合标记抗体，进而将标记抗体内吞入肿瘤细胞，使更多的肿瘤细胞与标记抗体结合，进而被杀死，最终达到治疗目的。
, 百拇医药
基金项目：江门市重点科技攻关项目(1999-46)
作者简介：李仲宏(1944-)，男，广东江门人，1969年毕业于广东医学院，副主任医师，电话：0750-3325813
参考文献：
[1] 邓敬兰，李宝安. 131I-MGb单克隆抗体对荷胃癌裸鼠放射免疫治疗的实验研究[J]. 中华核医学杂志, 1993, 13(3):176-8.
[2] Wilder RB, Denardo GL, Denard SJ. Radioimmunotherapy: recent results and future direction[J]. J Clin Oncol, 1996, 14:1383-400.
[3] 刘康达，汤钊猷，陆继珍，等. 肝癌导向治疗疗效评估[J]. 中华肿瘤杂志, 1992, 14(6):430-2.
, 百拇医药
[4] 秦云才，彭 勇，杨思齐，等. 131I-MG7胃镜内注射治疗的临床研究[J]. 中华消化内镜杂志, 1998, 15(3):136-8.
[5] Hopkins K, Khandler C, Eatough J, et al. Direct injection of 90Y MoAbs into glioma tumor resection cavities leads to limited diffusion of radio- immunoconjugates into normal brain parenchyma: a model to estimate absorbed radiation dose[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1998, 40(4): 835-44.
[6] 李爱民，罗荣城. 肿瘤放射免疫治疗面临的问题及对策[J]. 国外医学 肿瘤学分册, 1999, 26(3):160-2.
收稿日期：2000-06-06, http://www.100md.com
单位：李仲宏(江门市人民医院，广东 江门 529000)；麦国丰(江门市人民医院，广东 江门 529000)；罗荣城(第一军医大学南方医院肿瘤科，广东 广州510515)；李爱民(第一军医大学南方医院肿瘤科，广东 广州510515)
关键词：肝肿瘤；放射免疫治疗；单克隆抗体；瘤内注射
第一军医大学学报000407 摘要：目的 为临床应用混合抗体进行瘤内注射放射免疫治疗提供实验依据。方法 在裸鼠荷人肝癌2.2.15移植瘤生长至1 cm时，瘤内分别或同时注射131I标记的抗癌胚蛋白(AFP)单克隆抗体(131I AFP-IT)和131I标记抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体S102(131I- S102-IT)，治疗后行SPECT显像观察标记抗体在肿瘤内的浓聚，并进行疗效观察。 结果 发现两种标记抗体联合治疗组肿瘤抑制率为76.5%，明显高于131I AFP-IT组的53.1%及131I- S102-IT组的47.3%，抗体在肿瘤内的浓聚也明显高于单独应用组。结论 多种抗体混合应用瘤内注射放射免疫治疗可增加标记抗体在肿瘤内的浓聚，并能提高放射免疫治疗的疗效。
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中图分类号：R332; R457.2; R735.7 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0327-02
Experimental studies of treatment of the liver cancer by intratumoral injection of 131I-labeled multiple monoclonal antibodies
LI Zhong-hong, MAI Guo-feng
(Jiangmen People’s Hospital of Guangdong, Jiangmen 529000, China)
LUO Rong-cheng,LI Ai-min
, http://www.100md.com
(Department of Oncology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract：Objective To provide experimental basis for radioimmunotherapy of tumors by intratumoral infection of 131I-labeled multiple monoclonal antibodies. Methods Nude mice bearing subcutaneous human liver carcer xenografts were treated by intratumoral injection of 131I-labeled anti-AFP (a-fetoprotein) monoclonal antibody (131I-AFP) and/or 131I-labeled anti-HbsAg monoclonal antibody S102 (131I- S102). The alteration of the tumor size was observed and the radioactivity concentrations in the tumor, liver, blood and kidney were measured. Result It was found that the inhibition rate of the tumor in the group treated with 131I- AFP and 131I- S102 (76.5%) was higher than that in the group treated with 131I- S102 (47.3%) or 131I- AFP (53.1%) alone. The radioactivity concentration ratio of tumor to normal tissue (T/NT) in the group treated with 131I-AFP and 131I- S102 was higher than that in the group treated with 131I- S102 or 131I- AFP alone. Conclusion Intratumoral injection of 131I-labeled multiple monoclonal antibodies can increase the concentration of 131I-labeled monoclonal antibodies in tumor and enhance the efficacy of the radioimmunotherapy .
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Key words：liver neoplasms; radioimmunotherapy; monoantibody; intratumoral injection
肿瘤放射免疫治疗是以单抗为载体，将放射性核素导向肿瘤区，对肿瘤进行内照射。由于肿瘤细胞的异质性及肿瘤抗原调变等因素的影响，细胞表达抗原有很大的差异，单独应用某种抗体进行导向治疗往往难以达到满意的治疗效果。目前国内外应用混合抗体进行放射免疫治疗的研究很少，而应用混合抗体瘤内注射法进行放射免疫治疗尚未见有报道。为了探讨多种抗体联合应用对放射免疫治疗疗效的影响，我们采用了131I-AFP及131I-S102同时瘤内注射的方法，对裸鼠荷人肝癌移植瘤进行治疗，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
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抗AFP抗体及抗HbsAg单克隆抗体S102均由第一军医大学南方医院肿瘤科实验室研制，131I购自原子能研究设计院第一研究所。
1.2 抗体标记
采用Iodogen法进行单抗AFP及S102的131I标记，标记率及放化纯度分别为48.7%、99.3%和51.6%、99.5%，比放射活度分别为1 480 MBq.10 mg-1.ml-1及1 500 MBq.10 mg-1.ml-1。
1.3 实验动物模型
6周龄雄性裸小鼠(BALB/c)由第一军医大学实验动物中心提供。在右背部皮下接种人肝癌细胞株2.2.15，1×107/鼠，2～3周后肿瘤长径在1 cm左右时注射药物。
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1.4 实验分组
分4组进行实验，每组取荷瘤裸鼠6只，比放射活度均为14.8 MBq。第1组，瘤内注射131I-AFP 10 μl；第2组，瘤内注射131I-S102 10 μl；第3组，瘤内注射131I-AFP 5 μl及131I-S102 5 μl；第4组，瘤内注射生理盐水10 μl。
1.5 SPECT显像
瘤内注射药物5 d后，将荷瘤裸鼠麻醉后进行SPECT显像，观察标记抗体在裸鼠体内的分布情况。
1.6 疗效观察
注射药物后每天观察裸鼠的生长、生活情况，每周测量肿瘤的长径、短径，按下列公式计算移植瘤体积及移植瘤生长抑制率[1]：
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移植瘤体积=(长径×短径2)/2移植瘤生长抑制率=(对照组体积-实验组体积)/对照组体积×100%
2 结果
2.1 标记抗体体内分布
由表1可见，瘤内注射5 d后，两种标记抗体混合应用组比放射性活度瘤/非瘤值(T/NT)明显大于131I-S102-IT或131I-AFP-IT组，P<0.05。说明两种抗体混合应用有利于标记抗体在肿瘤内浓聚。
表1 肿瘤与正常组织放射性活度比(n=6,
±s, T/NT)Tab.1 Radioactivity concentration ratio of the tumor to normal tissue
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( n=6，Mean±SD, T/NT)
Group
Tumor/Blood
Tumor/Liver
Tumor/Kidney
131I-S102-ITI-S102-IT
5.36±0.76
2.18±0.61
3.19±0.51
131I-AFP-ITI-AFP-IT
, 百拇医药
4.15±0.54
2.37±0.42
3.42±0.66
Combination
7.93±1.24
3.84±0.55
6.06±1.09
2.2 肿瘤抑制率
由表2可见，131I-S102 和131I-AFP 混合组肿瘤抑制率为76.5%，明显高于131I-S102-IT 组的47.3%及131I-AFP-IT 组的53.1%，P<0.05。说明两种标记抗体混合应用具有协同作用，可提高肿瘤的治疗效果。
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表2 放射免疫疗效观察(n=6,
±s)Tab.2 Curative effects of radioimmunotherapy ( n=6，Mean±SD)
Group
Tumor size (cm3)
Inhibition rate (%)
Before
After 3 weeks
Control
0.49±0.12
, 百拇医药
2.26±0.39
-
131I- S102 ITI- S102 IT
0.50±0.12
1.19±0.17
47.3
131I-AFP -ITI-AFP -IT
0.51±0.11
1.06±0.31
53.1
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Combination
0.50±0.17
0.53±0.26
76.5
3 讨论
肝癌的放射免疫治疗中存在以下几个问题[1～3]，(1)血液稀释、肿瘤血管屏障、抗体穿透性差等因素的影响使标记抗体最终到达肿瘤内的剂量太小，难以达到根治剂量；(2)标记抗体杀伤力弱；(3)肿瘤抗原表达存在明显的差异。针对上述问题，我们进行了放射性核素标记混合抗体导向治疗肝癌的实验研究，发现可明显提高治疗效果。瘤内注射后，核素标记单克隆抗体不需要经过血液循环，直接进入肿瘤组织，并在肿瘤组织内扩散，可明显增加标记抗体在肿瘤内的浓聚，增强肿瘤细胞受照射的剂量，使更多的肿瘤细胞被杀伤，提高肝癌的导向治疗效果[4、5]。
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核素标记抗肿瘤单克隆抗体对肿瘤细胞的杀伤范围在几个细胞直径以内，且需要与肿瘤细胞表面相关抗原结合，经细胞的内吞作用，使标记抗体进入细胞内，对核内DNA进行短距离的照射，达到肿瘤治疗作用。因此，如何提高核素标记抗体与肿瘤细胞的结合剂量，是提高放射免疫治疗疗效必须解决的问题。而肿瘤细胞的抗原表达具有异质性，同一块肿瘤组织有多种抗原性，甚至同一肿瘤不同肿瘤细胞或细胞亚群间的抗原性也不一样，因此在不同肝癌或同一肝癌的不同细胞亚群之间，癌细胞的抗原表达都不同，并且由于抗原调变的存在，同一肿瘤细胞不同时期表达的抗原也不一样[6]。单独应用某一抗体进行导向治疗时，由于抗原异质性及抗原调变的影响，不表达相应抗原的肿瘤细胞不能与核素标记抗体结合。我们采用混合抗体作为导向载体，将不同的核素标记抗体直接注入肿瘤内，发现可明显提高肿瘤的治疗效果，其原因可能是核素标记混合抗体瘤内注射后，不同的抗体可与不同的肿瘤相关抗原结合，使表达不同抗原的肿瘤细胞均能结合标记抗体，进而将标记抗体内吞入肿瘤细胞，使更多的肿瘤细胞与标记抗体结合，进而被杀死，最终达到治疗目的。
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基金项目：江门市重点科技攻关项目(1999-46)
作者简介：李仲宏(1944-)，男，广东江门人，1969年毕业于广东医学院，副主任医师，电话：0750-3325813
参考文献：
[1] 邓敬兰，李宝安. 131I-MGb单克隆抗体对荷胃癌裸鼠放射免疫治疗的实验研究[J]. 中华核医学杂志, 1993, 13(3):176-8.
[2] Wilder RB, Denardo GL, Denard SJ. Radioimmunotherapy: recent results and future direction[J]. J Clin Oncol, 1996, 14:1383-400.
[3] 刘康达，汤钊猷，陆继珍，等. 肝癌导向治疗疗效评估[J]. 中华肿瘤杂志, 1992, 14(6):430-2.
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[4] 秦云才，彭 勇，杨思齐，等. 131I-MG7胃镜内注射治疗的临床研究[J]. 中华消化内镜杂志, 1998, 15(3):136-8.
[5] Hopkins K, Khandler C, Eatough J, et al. Direct injection of 90Y MoAbs into glioma tumor resection cavities leads to limited diffusion of radio- immunoconjugates into normal brain parenchyma: a model to estimate absorbed radiation dose[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1998, 40(4): 835-44.
[6] 李爱民，罗荣城. 肿瘤放射免疫治疗面临的问题及对策[J]. 国外医学 肿瘤学分册, 1999, 26(3):160-2.
收稿日期：2000-06-06, http://www.100md.com