乙型肝炎表面抗原疑难判定血清的研究
林京香 王佑春 张华远
摘 要：用中国药品生物制品检定所检定合格的国内外HBsAg EIA试剂及ABBOTT抗-HBs、抗-HBc EIA试剂，对所收集的13份HBsAg疑难判定血清进行检测，并用PCR方法检测血清中HBV DNA，结果显示国内外HBsAg试剂对部分HBV DNA阳性样品的检出率差异较大，提示这些样品可能为S基因突变株或HBsAg含量较低，因此，HBsAg EIA试剂的敏感度仍有待进一步提高，并应进一步研制检测S基因突变株的HBsAg诊断试剂。
关键词：乙肝表面抗原 S基因突变 诊断试剂
近年，国内外均有许多关于乙型肝炎病毒(HBV)基因突变的报道，HBV S基因突变可以逃避机 体抗-HBs免疫，使乙肝疫苗免疫失败[1～3]。通过对HBsAg突变体基因表达产物 的抗原性分析，显示不同突变体之间存在着抗原性的差异[4，5]。因此，用不同 HBsAg酶联免疫(EIA)试剂检测同一份血清，其结果有可能截然不同，即临床上发现HBsAg指 标漏检。我们从国内不同地区收集用两种以上试剂检测结果不一致的血清，分别用ABBOTT等 4家 进口和17家国产HBsAg EIA国家批批检定合格试剂及ABBOTT抗-HBs、抗-HBc EIA试剂进行 检测，并用PCR方法检测血清中的HBV DNA，以便确诊是否为HBV感染，现将结果报告如下：
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1 材料和方法
1.1 血清 13份HBsAg疑难判定血清，分别来自于北京血液中心、武汉生物制品研究所、成都生物制品研究所、兰州生物制品研究所、厦门新创科技有限公司、洛阳华美生物工程公司。
1.2 试剂 17家国产HBsAgEIA试剂为国家批批检定合格产品；4家国外HBsAgEIA诊断试剂分别来自美国亚培制药有限公司、美国强生傲拓诊断系统有限公司、荷兰阿克苏若贝尔公司和美国Geneticsystems公司；抗-HBsEIA和抗-HBcEIA为美国亚培制药有限公司产品。
1.3 免疫学检测方法 国内外HBsAgEIA试剂及抗-HBc试剂对13份血清样本的检测，均严格按使用说明书操作及判断结果。HBsAg阳性样品以实际OD值与试剂临界值(cutoff value)之比(S/C)表示。
1.4 HBV DNA PCR检测 按华美公司D NA提取试剂盒操作说明书提取DNA，取5μL DNA提取液，加5μL 10×buffer，4μLMgCl2(25mmol/L)，1μLdNTP(10mmol/L)，25pmol/L外引物，2.5uTaqDNA聚合酶，加去离子水至50μL反应体积。扩增程序为：94℃1min,55℃1min,72℃1min,30个循环，最后72℃延伸10min。取第一轮PCR产物5μL，内引物各25pmol/L，其它试剂量及反应程序同上，进行第二轮PCR扩增。
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2 结果
2.1 国外四种HBsAg试剂的检测结果 用四种进口HBsAg试剂检测13份血清，结果有4个样品，即1、2、3和13号(占4/13)为四种试剂全部阳性；有1个样品，即3号(占1/13)，为三种试剂阳性；有1个样品，即9号(占1/13)，为二种试剂阳性；有4个样品，即5、6、7和10号(占4/13)，为一种试剂阳性；有3个样品，即8、11和12号(占3/13)，为四种试剂全部阴性(见表1)。
表1 13份HBsAg可疑样品的检测结果
Table 1 Detection of 13 indeterminate HBsAg samples
编号
No.
ABBOTT*
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Aks*
Or*
Gen*
PCR
cAb
SAb*
国内#
In C hina
1
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注：*：“-”表示阴性，阳性者以S/CO值表示，S/CO>1者为阳性；
*：“-”represents negative; The positive is showed as S/CO value.
#：分母表示所用试剂数，分子表示为阳性反应的试剂数。
#：Denominator represents numbers of used kits and numerator represents
numbers of reactive kits.
2.2 HBV DNA PCR检测结果 用PCR法检测13份样品中HBVDNA，结果见表1。4份用四种进口HBsAg试剂检测均阳性者中，有3例为HBVDNA阳性；1份用3种进口HBsAg试剂检测阳性者为HBVDNA阳性；1份用2种进口HBsAg试剂检测阳性者为HBVDNA阳性；4份用一种进口HBsAg试剂检测阳性者中，有3例为HBVDNA阳性。说明HBsAg与HBVDNA的检测结果不一致，因此，对疑难血清的判断应以DNA检测结果为准。
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2.3 抗-HBc检测结果 除1和4号为抗-HBc阴性以外，其余均为阳性(见表1)。特别是4份用4种进口HBsAg试剂检测均为阴性者而HBVDNA为阳性的血清，其抗-HBc也为阳性，提示在献血员的筛选中增加抗-HBc指标可以减少HBV漏检的机率。
2.4 抗-HBs检测结果 用抗-HBs试剂检测13份血清，结果见表1。6份HBVDNA阳性血清其抗-HBs为阴性；而4份HBVDNA阳性血清其抗-HBs也为阳性，这可能为HBV滴度较低或HBV基因序列发生变异，造成HBV与抗-HBs共同存在。
2.5 国内17种HBsAgEIA试剂检测结果 用国内17种HBsAgEIA试剂对13份血清进行检测，对11份HBVDNA阳性血清，即1、2、3、5、6、8、9、10、11、12和13的检出率分别为5/17、1/17、3/17、0/15、0/15、0/15、7/17、6/17、7/17、6/15、3/15和10/14。说明我国不同厂家HBsAgEIA诊断试剂检出率不同，其敏感度仍有待进一步提高。
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3 讨论
目前认为初期感染野型株HBV的患者，当恢复期体内出现抗-HBs后，野型株逐渐被清除，但在抗体压力下，部分野型株可能演化成S基因突变株，从而抗-HBs和HBsAg同时存在；即使体内尚无S基因突变形成，由野型株感染引生的抗-HBs，只能防止野型株再感染而不能防止S基因突变株再感染。在这种情况下，体内就有可能同时存在野型株感染引起的的抗-HBs和S基因突变株的持续感染，而且这种HBsAg不易被目前诊断试剂检出。本研究检测的5份抗-HBs阳性样品中有4份HBVDNA阳性，说明HBVDNA与抗-HBs抗体同时存在，这种HBVDNA可能为S基因突变株(有待进一步测序证实)。用抗-HBc试剂检测发现，部分HBVDNA阳性而HBsAg阴性的样品，其抗-HBc为阳性。由于HBV经血传播，目前只筛选HBsAg，但由于存在着变异株，不易被当前HBsAg诊断试剂检出。因此，研究对变异株的检测方法是减少输血后传染肝炎的当务之急。
本研究所用免疫检测试剂为中国药品生物制品检定所检定的特异性、敏感度、精密度等均合格的国内外试剂。实验表明，得出可靠、可信的结果，试剂的质量是关键，但操作人员素质以及实验室条件也是不可忽视的问题，特别是PCR高效扩增，其产物污染极易导致假阳性，因此，在实验室中应建立核酸提取、母液配制、产物检测等相对封闭的空间，以减少PCR的污染。■
, 百拇医药
作者简介：林京香(1954-)，女，山东省文登县人，助研，北京大学本科毕业，从事乙肝、戊肝诊断剂质控参考品研制及试剂质量的研究。
作者单位：林京香(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
王佑春(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
张华远(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
参考文献：
[1]吕晴，朱启荣，段怒城等.乙型肝炎疫苗免疫失败小儿S基因变异及临床特点的研究[J].中华肝脏病杂志，1997，5(1)：15～16
[2]Yamamoto M, Okamoto H, Mayumi A et al. Naturally occurring escape mut ant of hepatitis B virus with various mutants in Sgene in carriers seropositive for antibody to hepatitis surface antigen [J]. J Virol, 1994,68:2671～2676
[3]Carman WF, Zaretti AR, Karayianuis P et al. Vaccine induced escape mu tant of hepatitis virus [J]. Lancet, 1990, 336:325～329
[4]钟熙，王佑春，R Ling等. 用现行国产HBsAg EIA检测乙肝S基因突变体问题的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1998，18(2)：85～87
[5]王佑春，R Ling，倪建等. 乙型肝炎病毒S基因变异株抗原表位的研究[J]. 中国生物制品学杂志，1997，10(2)：68～70, 百拇医药
摘 要：用中国药品生物制品检定所检定合格的国内外HBsAg EIA试剂及ABBOTT抗-HBs、抗-HBc EIA试剂，对所收集的13份HBsAg疑难判定血清进行检测，并用PCR方法检测血清中HBV DNA，结果显示国内外HBsAg试剂对部分HBV DNA阳性样品的检出率差异较大，提示这些样品可能为S基因突变株或HBsAg含量较低，因此，HBsAg EIA试剂的敏感度仍有待进一步提高，并应进一步研制检测S基因突变株的HBsAg诊断试剂。
关键词：乙肝表面抗原 S基因突变 诊断试剂
近年，国内外均有许多关于乙型肝炎病毒(HBV)基因突变的报道，HBV S基因突变可以逃避机 体抗-HBs免疫，使乙肝疫苗免疫失败[1～3]。通过对HBsAg突变体基因表达产物 的抗原性分析，显示不同突变体之间存在着抗原性的差异[4，5]。因此，用不同 HBsAg酶联免疫(EIA)试剂检测同一份血清，其结果有可能截然不同，即临床上发现HBsAg指 标漏检。我们从国内不同地区收集用两种以上试剂检测结果不一致的血清，分别用ABBOTT等 4家 进口和17家国产HBsAg EIA国家批批检定合格试剂及ABBOTT抗-HBs、抗-HBc EIA试剂进行 检测，并用PCR方法检测血清中的HBV DNA，以便确诊是否为HBV感染，现将结果报告如下：
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1 材料和方法
1.1 血清 13份HBsAg疑难判定血清，分别来自于北京血液中心、武汉生物制品研究所、成都生物制品研究所、兰州生物制品研究所、厦门新创科技有限公司、洛阳华美生物工程公司。
1.2 试剂 17家国产HBsAgEIA试剂为国家批批检定合格产品；4家国外HBsAgEIA诊断试剂分别来自美国亚培制药有限公司、美国强生傲拓诊断系统有限公司、荷兰阿克苏若贝尔公司和美国Geneticsystems公司；抗-HBsEIA和抗-HBcEIA为美国亚培制药有限公司产品。
1.3 免疫学检测方法 国内外HBsAgEIA试剂及抗-HBc试剂对13份血清样本的检测，均严格按使用说明书操作及判断结果。HBsAg阳性样品以实际OD值与试剂临界值(cutoff value)之比(S/C)表示。
1.4 HBV DNA PCR检测 按华美公司D NA提取试剂盒操作说明书提取DNA，取5μL DNA提取液，加5μL 10×buffer，4μLMgCl2(25mmol/L)，1μLdNTP(10mmol/L)，25pmol/L外引物，2.5uTaqDNA聚合酶，加去离子水至50μL反应体积。扩增程序为：94℃1min,55℃1min,72℃1min,30个循环，最后72℃延伸10min。取第一轮PCR产物5μL，内引物各25pmol/L，其它试剂量及反应程序同上，进行第二轮PCR扩增。
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2 结果
2.1 国外四种HBsAg试剂的检测结果 用四种进口HBsAg试剂检测13份血清，结果有4个样品，即1、2、3和13号(占4/13)为四种试剂全部阳性；有1个样品，即3号(占1/13)，为三种试剂阳性；有1个样品，即9号(占1/13)，为二种试剂阳性；有4个样品，即5、6、7和10号(占4/13)，为一种试剂阳性；有3个样品，即8、11和12号(占3/13)，为四种试剂全部阴性(见表1)。
表1 13份HBsAg可疑样品的检测结果
Table 1 Detection of 13 indeterminate HBsAg samples
编号
No.
ABBOTT*
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Aks*
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注：*：“-”表示阴性，阳性者以S/CO值表示，S/CO>1者为阳性；
*：“-”represents negative; The positive is showed as S/CO value.
#：分母表示所用试剂数，分子表示为阳性反应的试剂数。
#：Denominator represents numbers of used kits and numerator represents
numbers of reactive kits.
2.2 HBV DNA PCR检测结果 用PCR法检测13份样品中HBVDNA，结果见表1。4份用四种进口HBsAg试剂检测均阳性者中，有3例为HBVDNA阳性；1份用3种进口HBsAg试剂检测阳性者为HBVDNA阳性；1份用2种进口HBsAg试剂检测阳性者为HBVDNA阳性；4份用一种进口HBsAg试剂检测阳性者中，有3例为HBVDNA阳性。说明HBsAg与HBVDNA的检测结果不一致，因此，对疑难血清的判断应以DNA检测结果为准。
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2.3 抗-HBc检测结果 除1和4号为抗-HBc阴性以外，其余均为阳性(见表1)。特别是4份用4种进口HBsAg试剂检测均为阴性者而HBVDNA为阳性的血清，其抗-HBc也为阳性，提示在献血员的筛选中增加抗-HBc指标可以减少HBV漏检的机率。
2.4 抗-HBs检测结果 用抗-HBs试剂检测13份血清，结果见表1。6份HBVDNA阳性血清其抗-HBs为阴性；而4份HBVDNA阳性血清其抗-HBs也为阳性，这可能为HBV滴度较低或HBV基因序列发生变异，造成HBV与抗-HBs共同存在。
2.5 国内17种HBsAgEIA试剂检测结果 用国内17种HBsAgEIA试剂对13份血清进行检测，对11份HBVDNA阳性血清，即1、2、3、5、6、8、9、10、11、12和13的检出率分别为5/17、1/17、3/17、0/15、0/15、0/15、7/17、6/17、7/17、6/15、3/15和10/14。说明我国不同厂家HBsAgEIA诊断试剂检出率不同，其敏感度仍有待进一步提高。
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3 讨论
目前认为初期感染野型株HBV的患者，当恢复期体内出现抗-HBs后，野型株逐渐被清除，但在抗体压力下，部分野型株可能演化成S基因突变株，从而抗-HBs和HBsAg同时存在；即使体内尚无S基因突变形成，由野型株感染引生的抗-HBs，只能防止野型株再感染而不能防止S基因突变株再感染。在这种情况下，体内就有可能同时存在野型株感染引起的的抗-HBs和S基因突变株的持续感染，而且这种HBsAg不易被目前诊断试剂检出。本研究检测的5份抗-HBs阳性样品中有4份HBVDNA阳性，说明HBVDNA与抗-HBs抗体同时存在，这种HBVDNA可能为S基因突变株(有待进一步测序证实)。用抗-HBc试剂检测发现，部分HBVDNA阳性而HBsAg阴性的样品，其抗-HBc为阳性。由于HBV经血传播，目前只筛选HBsAg，但由于存在着变异株，不易被当前HBsAg诊断试剂检出。因此，研究对变异株的检测方法是减少输血后传染肝炎的当务之急。
本研究所用免疫检测试剂为中国药品生物制品检定所检定的特异性、敏感度、精密度等均合格的国内外试剂。实验表明，得出可靠、可信的结果，试剂的质量是关键，但操作人员素质以及实验室条件也是不可忽视的问题，特别是PCR高效扩增，其产物污染极易导致假阳性，因此，在实验室中应建立核酸提取、母液配制、产物检测等相对封闭的空间，以减少PCR的污染。■
, 百拇医药
作者简介：林京香(1954-)，女，山东省文登县人，助研，北京大学本科毕业，从事乙肝、戊肝诊断剂质控参考品研制及试剂质量的研究。
作者单位：林京香(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
王佑春(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
张华远(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
参考文献：
[1]吕晴，朱启荣，段怒城等.乙型肝炎疫苗免疫失败小儿S基因变异及临床特点的研究[J].中华肝脏病杂志，1997，5(1)：15～16
[2]Yamamoto M, Okamoto H, Mayumi A et al. Naturally occurring escape mut ant of hepatitis B virus with various mutants in Sgene in carriers seropositive for antibody to hepatitis surface antigen [J]. J Virol, 1994,68:2671～2676
[3]Carman WF, Zaretti AR, Karayianuis P et al. Vaccine induced escape mu tant of hepatitis virus [J]. Lancet, 1990, 336:325～329
[4]钟熙，王佑春，R Ling等. 用现行国产HBsAg EIA检测乙肝S基因突变体问题的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1998，18(2)：85～87
[5]王佑春，R Ling，倪建等. 乙型肝炎病毒S基因变异株抗原表位的研究[J]. 中国生物制品学杂志，1997，10(2)：68～70, 百拇医药