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编号:10211179
多发伤后β-内腓肽和细胞粘附分子表达变化及临床意义
http://www.100md.com 《重庆医学》 2000年第6期
     作者:姚元章 李磊 简华刚 程晓斌 黄显凯

    单位:第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心 重庆 400042

    关键词:创伤和损伤;神经肽;细胞粘附分子;ISS

    重庆医学000605

    摘 要 目的 探讨多发伤病人血清β-end及外周血多形核粒 细胞(PMNs)CD18、CD54表达变化。方法 使用放免分析技术和流式细 胞术分别检测65例多发伤伤员入院时、伤后1、3、7天血清皮质醇、β-end浓度和PMNs上CD 18、CD54的平均荧光通道(MFC)变化,13例健康志愿者为对照组。结果 创伤病人血清皮质醇浓度在伤后24小时内较对照组高(P<0.001),但创伤组间无差异;β -end浓度入院时达高峰,随后迅速下降,伤后第72小时恢复正常;伤后24小时内ISS≥20分 组较ISS<20分组更高(P<0.01)。PMNs上CD18、CD54表达在创伤后各时相点上与对照组比较有 显著差异(P<0.001),在伤后最初3天内,ISS≥20分组较ISS<20分组明显增高(P<0.01)。结论 β-end、细胞粘附分子共同参与了创伤后PMNs的活化过程, 其浓度和表达变化与损伤严重程度相平行;动态变化监测有益于伤情评估。
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    Changes of Serum Levels of Neuropeptide and Expression of Cell ular Adhesion Molecules Following Multiple Injuries

    Yao Yuanzhang,Li Lei, Jian Huagang,Chen Xiao Bin,Huan Xian Kai

    (The Center of War Wound and trauma, Daping Hospital,Third Mil itary Medical University,Chongqing 400042)

    Abstract Objective:To investigate the changes of serum levels of neruopeptide(β-end) and expression of cellular adhesion molecules(C D18,CD54) on peripheral polymorphonuclear neutrophils(PMNs) in patients with mul tiple injuries.Methods:Sixty-five patients with multiple injuries(mean Injury Severity Score of 20.5) were studied. Venous blood samples were collected on admission and 1,3 and 7 days after injury. Serum corticostero ne,β-end were respectively measured by radioimmunoassay.CD18,CD54 expression w as quantified by flow cytometry and compared with thirteen healthy volunteers(co ntrol group).Results:Although the serum levels of corticos terone were significantly elevated in all patients over controls within 24 hours after injury(P<0.001),there were no statistically difference in trauma patients . Serum peak values of β-end were measured on admission in 65 subjects and app eared to be higher than controls at first 24 hours after the accident(P<0.001).O ver the next days,its concentration in serum fell considerably and returned to c ontrol levels by 72h. The β-end values in patients with ISS≥20 considerably r aised above those with ISS<20 within 24 hours following injuries(P<0.01). PMNs C D18,CD54 expression in all trauma victims was significantly raised above control group throughout the study period(P<0.001).The expression of CD18,CD54 appeared to be higher in patients with ISS≥20 than in those with ISS<20 within the firs t 3 days following injury(P<0.01).Conclusion:These finding s suggest that posttraumatic β-end and cellular adhesion molecules may partici p ate differently in PMNs activation.Up-regulated expression of CAM and serum inc reased levels of β-end were parallel to injury severity. Monitor of dynamic ch anges of parameters may be benefit for assessing injury severity.
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    Key words:Wounds and injuries Neuropeptides Cellular adh esion molecules ISS

    创伤后急性炎症反应初始阶段,由细胞膜表面粘附分子介导的白细胞沿内皮细胞(EC)滚动、 粘附,是白细胞趋化、游走、聚集的基础,同时也与创伤后多种并发症的发生有关[1 ]。目前神经肽、皮质醇等是否参与了创伤后白细胞的活化过程,尚缺乏直接依据;创伤 后神经肽、皮质醇的变化及与细胞粘附分子(CAM)表达的关系,临床报道较少。本研究通过 观察多发伤病人早期不同时相血清β-内啡肽(β-end)、皮质醇浓度及CD18、CD54分子表 达变化,探讨他们与损伤严重程度及相互间关系,为创伤的早期治疗及并发症的防治提供参 考。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象

, http://www.100md.com     1.1.1 病例来源 1997年10月至1999年5月创伤中心收治的65例多发病人 。损伤严重程度评分(ISS)为12~45分(平均20.5分),男性38例,女性27例;平均年龄42. 7岁,伤后平均入院时间为4.5小时;交通事故伤37例,挤压伤6例,坠落伤12例,穿透伤10 例。

    1.1.2 病例选择标准 (1)入院时间为伤后7小时以内;(2)年龄18~70岁 ;(3)至少有一个部位损伤AIS(简明损伤部位评分)分值(90版)≥3分,并超过一个解剖区域 ;(4)伤后生存时间>48小时;(5)排除有妊娠,至少在一个月前无细菌和病毒感染、慢性疾 病及使用过对免疫功能有明显抑制的药物,输血在2单位以内。

    1.1.3 分组 按ISS将65例多发伤病人分为两组:ISS≥20分组(n=36)和I SS<20(n=29)。

    1.1.4 对照组 13例健康自愿者为对照组,年龄20~45岁,平均年龄37 岁,男∶女为9∶4。
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    1.2 仪器及试剂

    1.2.1 仪器 GC-1200γ自动放免计数器(北京,中国科学技术实业总公 司中佳光电仪器分公司生产):FAC流式细胞仪(美国COULTER公司生产)。

    1.2.2 试剂来源 皮质醇、β-end放免测定药盒分别由北京北方生物技 术研究所和北京东雅生物技术研究所提供;流式细胞仪分析用单克隆抗体(mAb)为异硫氰酸 荧光素(FITC)直接标记的鼠抗人CD54 mAb,藻红蛋白(PE)标记的CD18 mAb,鼠IgG1-FITC(PE) 作阴性对照,由美国COULTER公司提供(Immuntech公司产品)。

    1.3 标本的采集和检测方法

    1.3.1 标本的采集 入院后立即采取外周静脉血5ml,以后分别于伤后24 、72、168小时各采集一次,流式细胞仪检测标本置于10%EDTA抗凝管中,标本4℃冰箱保存 ,放置时间不超过12小时;放免检测标本为血清,置-20℃冰箱保存,批量检测。
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    1.3.2 标记和分析方法 放射免疫分析为取2ml血清标本,测定前置室温 或冷水中复融混匀,4℃3000rpm离心5min,取上清测定,放免试剂均为I125标记 ,采用平衡饱和分析法,具体操作方法按试剂盒说明书操作,由自动γ-放免计数器直接给 出样本浓度。流式细胞仪分析用抗体标记方法为取微量全血100μl加单抗20μl,混匀,25 ℃15分钟;加入红细胞裂解液,轻混匀,25℃(室温)10分钟,加入PBS(磷酸缓冲液)500μl, 25℃(室温)下静置10分钟上机检测;每标本至少含有5000个多形核粒细胞(PMNs),使用流式 细胞仪和LYSYS-Ⅱ计算机软件(Becton-Dickinson)分析,据PMNs的形态学特征在前相散射 对应的侧散射展示的点状图形上开窗,使用标准的FITC或PE滤器收集荧光强度,减去阴性对 照值获得平均荧光通道(MFC)值(对数值),MFC直接反应了PMNs上抗体的密度。

    1.4 统计学处理

    所测数据以均数±标准差(±s)表示,组间数据比较采用两样本均数的t检验, 并作单因素相关分析,P<0.05为差异有显著性。
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    2 结果

    应用放射免疫分析检测创伤后血清不同时相皮质醇、β-end浓度及使用流式细胞术间接免 疫荧光法检测外周血PMNs上CD18、CD54表达的强弱(MFC),结果见附表。

    附表 多发伤后血清皮质醇、β-end浓度及PMNs上CD18、CD54表达变化 (±s)

    对照组

    (n=13)

    ISS<20组(n=29)

    伤后时间(h)

    ISS≥20组(n=36)
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    伤后时间(h)

    4.5

    24

    72

    168

    4.5

    24

    72

    168

    皮质醇

    (ng/ml)

    230.6±51.4

    379.1±180.4*
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    396.4±140.3*

    24 7.3±166.7

    255.1±81.9

    368.7±187.3*

    396.6±125.3

    190.9±56.1

    202.7±93.4

    β-end

    (ng/ml)

    102.5±22.3

    202.6±80.8*
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    157.7±79.5*

    121.6±25.5

    101.2±16.1

    316.5±119.1*

    281.3±181 .9*

    98.8±27.2

    120.2±32.7

    CD18

    (MFC)

    1.32±0.47

    3.85±0.94*
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    3.61±1.21*

    2.12 ±0.85*

    1.62±0.83*

    4.87±0.92*

    4.95±1.09*

    4.73±1.36*

    1.95±0.89*

    CD54

    (MFC)

    1.20±0.35
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    1.74±0.48*

    2.29±0.70*

    1.91 ±0.51*

    1.70±0.42*

    2.18±0.64*

    2.78±0.87*

    2.72±0.81*

    1.84±0.58*

    * P<0.001 (创伤组 vs对照组,t检验)
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    ★ P<0.01 (ISS≥20组 vs ISS≥20组,t检验)

    # P<0.05 (ISS≥20组 vs ISS≥20组,t检验)

    2.1 两组伤员血清皮质醇激素在伤后24小时内均较对照组有明显增高(P <0.001),但两组伤员之间比较无差异,伤后72小时恢复正常。

    2.2 β-end血清浓度在两组伤员入院时即明显升高并呈现一高峰,与对 照组比差异非常明显(P<0.001),持续至伤后24小时,以后迅速下降,至伤后第72小时 恢复正常;伤后入院时、24小时两时相点上,ISS≥20分组较ISS<20分组更高P<0.01 )。

    2.3 PMNs上CD18表达在两组伤员入院时有明显增加,且峰值均出现在24小 时内,ISS≥20分组下降缓慢,峰值持续至伤后第3天,ISS<20分组下降幅度快,峰值维持时 间短;在伤后入院时、伤后24、72小时时相点上ISS≥20分组表达较ISS<20分组高,两组差 异非常显著(P<0.01);伤后第7天两组伤员CD18的表达仍维持一定水平,但ISS≥20分组 仍高于ISS<20分组(P<0.05)。在伤后各时相点上PMNs上CD18表达较对照组显著增高(P <0.001)。
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    2.4 多发伤后两组伤员PMNs上CD54表达在伤后各时相点上与对照组比较均 有明显增高(P<0.001);两组伤员CD54表达在入院时表达即明显增加,且伤后24小时达 高峰,其中伤后72小时内ISS≥20分组CD54表达显著高于ISS<20分组(P<0.01),24小时 后ISS<20分组快速下降,而ISS≥20分组仍持续较高水平,72小时后缓慢下降,伤后第七天 仍高于ISS<20分组(P<0.05)。

    2.5 相关分析发现血清β-end均值与PMNs上CD18、CD54表达变化间呈明 显的正相关(ISS<20分组γ值=0.9920,0.9787,P<0.01;ISS≥20分组γ值=0.942 5,0.8911,P<0.01)。

    3 讨论

    3.1 多发伤对β-end水平影响及与CAM的关系β-end是内源性阿片肽家 族成员之一,CD18、CD54属于CAM的整合素家族及免疫球蛋白超家族成员。阿片肽、CAM受体 均可在神经细胞、内分泌细胞及多种免疫细胞上表达,在周期性变化等方面有很多相似之处 ,生理情况下相互间处于完整的相互依赖、相互调控的正负反馈调节平衡状态,在创伤等因 素刺激影响下这种平衡可遭到破坏,引起一系列的病理生理紊乱[2]。有资料显示 β-end作为一种自损害因子可能参与了创伤后病理生理过程,在有内源性阿片肽的神经或 神经末梢受创伤刺激时β-end可大量释放,且与损伤的程度相平行[3];CD18、C D54在创伤急性炎症反应阶段,介导了细胞与细胞间、细胞与基质间的粘附,共同参与了细 胞活化、信息传导、细胞的伸展和移动,以及炎症和创伤愈合等一系列重要的病理生理过程 [4]
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    本研究观察到多发伤后早期皮质醇浓度明显高于对照组,虽然临床观察到不同创伤组病人应 激反应有差异,但伤后皮质醇变化差异均不明显,与一些临床报道不一致,需选择更多时相 点和更广泛的病例进一步研究。创伤组β-end浓度及CD18、CD54表达明显高于对照组,从 升高的时相及相关分析显示,β-end在入院时即升高并持续至伤后24小时,随后迅速下降 ,CD18、CD54的表达则在24小时达高峰,随β-end升高表达增加,且持续时间较β-end长 ;提示多发伤后神经肽与CAM间很可能存在某种相互调节的内在联系,过度的创伤应激反应 使皮质醇、β-end分泌增加,促进了免疫细胞的分泌功能,免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞 、淋巴细胞等)与激素结合,合成并释放多种细胞因子,活化了PMNs和EC而上调表达CD18、C D54,CAM的过量表达对皮质醇、β-end分泌又起反馈抑制作用,这就可以解释为什么伤后 皮质醇、β-end即明显升高并于24小时后快速下降、72小时恢复正常的原因;因此,创伤 后β-end也间接参与了创伤后PMNs和EC的活化过程。研究表明创伤后CAM的上调表达活化了 白细胞,使PMNs与EC粘附增强,活化的PMNs释放花生酸、蛋白水解酶、氧自由基等损害了EC ,血管通透性增加,导致广泛的组织器官功能损害和多种并发症[5]。创伤后神经 肽、CAM可能共同参与了组织器官的继发性损伤过程,有人把创伤后粘附分子的过量表达介 导的急性白细胞活化作为器官功能损害的“一个易受攻击的窗口”[6]。在多发伤 病人的临床治疗上,早期可适当给予糖皮质激素、抗阿片受体药物(如纳络酮)等,对减轻和 预防创伤后过度的应激和炎症反应、创伤并发症可能会带来有益作用;阻止这些CAM的过量 表达,有可能阻断创伤后组织器官功能继发性损害的始动因素或某一发病环节,对降低死亡 率、提高伤员生存率具有重要的临床指导意义[7]
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    3.2 多发伤后血清β-end水平、PMNs上CD18、CD54表达变化与损伤严重 程度的关系 多发伤诊治的一个重要进展是损伤严重度评估,虽为院内伤员的优先处理、诊 断程序模式的建立及指导治疗提供了判断标准,但多基于解剖部位损伤和生命体征变化的指 标评价,未涉及创伤后的生化和病理生理紊乱,存在一定的局限性[8]。因而通过 对损伤严重度评估作出创伤后内环境的稳定及死亡、创伤并发症危险性的预测,变得十分重 要,研究表明创伤后血清β-end浓度和CAM表达变化结合一些细胞因子对创伤的预后,伤情 严重度的判断,准确率超过80%[9]。本资料显示多发伤早期ISS≥20组血清中β- end水平、PMNs上CD18、CD54表达明显高于ISS<20组,并于伤后数小时或24小时内达高峰, 提示在创伤后PMNs活化引起CAM的上调表达和β-end浓度的升高是与损伤严重程度(ISS)相 平行的,显然β-end浓度及CD18、CD54分子表达变化在创伤后早期可以反应机体受第一次 打击的程度。因此,多发伤后早期血清神经肽水平增加和CAM的上调表达在一定程度上确能 反应创伤后的病理生理紊乱,反应损伤的严重程度,动态变化监测有助于伤情的评估及预后 判断。有人预测未来的损伤严重评估应是已确立的解释部位评分(如ISS等)和包括一些生化 参数(如β-end、CAM等)在内的生理学评分的结合[10]
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