深圳地区流行TTV的基因分型与基因变异
作者：李体远 戴勇 周伯平 孙彤
单位：李体远 戴勇 周伯平(518020 深圳市东湖医院)；孙彤(100071 北京市，中国军事医学科学院微生物研究所)
关键词：肝炎病毒；变异(遗传学)；基因型；序列分析；TT病毒
实用医学杂志000910 摘 要 目的：探讨深圳地区流行TTV病毒的主要基因型、基因变异状况。方法：采集长期维持性血液透析患者，以及非甲-非庚但血清ALT升高肝炎患者血清标本，提取病毒DNA后，巢式PCR扩增TTV ORF1部分基因，克隆、测序后，进行基因分型及基因变异分析。结果：对21例TTV ORF1部分基因进行序列分析，基因同源性为60.3%～98.5%。21例TTV分离株中，G1型17例，其中，G1a亚型16例，G1b亚型1例；G2型4例，其中G2a亚型0例，G2b亚型3例，另一例可能为新的亚型，命名为G2x。结论：深圳地区血液透析患者及非甲-非庚、但血清ALT升高患者流行TTV病毒的基因型主要为G1a亚型。TTV基因变异可达39.7%。
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TT病毒(transfusion transmitted virus，TTV)是日本科学家新近发现的一种可致人类肝炎的嗜肝病毒[1]，国内学者对此亦进行了研究[2]。我们对20余例TTV分离株进行了研究，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 血清标本分别采自深圳市四家大医院维持性血液透析患者(70例)，以及非甲-非庚、但血清ALT升高患者(10例)共计80例。血液透析患者中，原发病为慢性肾炎31例，糖尿病肾病9例、高血压肾病5例，其他为梗阻性肾病、肾移植术后排异、肾结核、多囊肾等共计25例，部分患者有输血史。巢式PCR扩增TTV DNA，将其中21例PCR阳性产物克隆、测序分析，分别命名为T1～T21。
1.2 标本处理 采集维持性血液透析患者透析前静脉血或非甲-非庚患者空腹静脉血5 ml，3 000 r/min离心分离血清。
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1.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTPs、低熔点琼脂糖购至Promega公司。质粒PUC 19等为Boeringer Mannerim公司产品。
1.4 TTV DNA的扩增 参照N22基因序列，设计两对TTV ORF1保守区巢式引物：P1 5′-ACAGACAGAG-GAGAAGGCAAC-3′，P2 5′-GGATACCTATTAGCTCTCAT
-3′，P3 5′-GGCAACATGTTATGGATAGAC-3′，P4 5′-CCTGGCATTTTACCATTTCCA-3’，其中，P1，P2为上、下游外引物，P3，P4为上、下游内引物，内引物扩增产物长272 bp。提取血清标本DNA，巢式PCR扩增。扩增条件：94℃ 40 s，56℃ 35 s，72℃ 45 s，共循环30次，最后72℃延伸7 min。进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物出现272 bp DNA条带视为阳性。
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1.5 TTV PCR产物的克隆及序列分析 低溶点琼脂糖法回收第2次PCR产物，插入质粒PUC，筛选阳性克隆。碱裂解法提取质粒，用通用引物双向测序。
1.6 DNA序列同源性比较 采用Goldkey软件(军事科学院)进行DNA序列分析，并与国外报道序列进行同源性比较。
1.7 TTV基因分型 根据Okamoto等[1]报道的分型标准，TTV型与型之间核酸同源性小于70%，亚型与亚型之间核酸变异为11%～15%。
2 结果
2.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 阳性标本扩增物可见272 bpDNA条带，与预期大小相同。
2.2 TTV DNA序列分析 对21例TTV分离株进行测序分析，结果见图1。
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2.3 TTV分离株同源性比较 对TTV各分离株核酸序列进行同源性分析，结果其同源性为60.3%～98.5%。
2.4 TTV分离株基因分型 11例血透患者中有10例均为G1a亚型，另1例由于与TS003及NA004的同源性仅分别为78.3%及70.2%，可能为新的亚型，我们将其命名为G2x。10例非甲-非庚肝炎TTV阳性患者中，G1a 6例，G1b 1例，G2b 3例。
2.5 TTV基因变异分析 与N22分离株相比较，在16例均属G1a亚型的分离株中，在扩增的ORF1序列区内，共有7个相对较高的突变点，分别位于nt1983，1987，1993，2027，2058，2116，2151。
3 讨论
由于血清中TTV病毒滴度不高且差异较大(102～104)，对TTV的扩增均采用巢式或半巢式PCR方法进行。所用PCR引物区段不同，病毒DNA提取方法的差异，或者PCR条件的变化，加上病毒自身的变异，都可能导致漏检。因此，研究我国不同人群、不同地域流行TTV的基因类型及基因变异状况，对于建立TTV特异检测方法，了解TTV的临床和流行病学特征，探索TTV的致病性，开发TTV疫苗，都具有重要意义。目前多用TTV ORF1区序列设计引物进行检测。有人在TTV ORF2区设计PCR引物，检出率相对不高。我们分别检测了非甲-非庚肝炎患者及肝炎病毒传播高危人群-血液透析患者中TTV感染状况，TTV ORF1 DNA检出率为35%(28/80)。
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注：T1～T21为TTV分离株，SZ1为文献报道的深圳分离株，N22，TX011，NA004及
TS003为日本分离株
图1 21例TTV分离株序列分析
到目前为止，有关TTV基因变异的资料不多。我们对检出的21株TTV分离株进行同源性分析，其核酸变异可达39.7%(同源性60.3%～98.5%)。依据Okamoto的基因分型方法，我们的结果提示，深圳地区流行的TTV基因型与日本有所不同，主要为G1a和G2b，而后者为G1a和G2a，且G2型TTV甚少，在检测的78例中仅有2例。在我们检测的21例TTV分离株中，G1a 16例、G1b 1例、G2a 0例，G2b 3例。分离株T11与NS 003序列同源性最高，但也仅有78.3%，故暂将其定为G2x亚型。在扩增的ORF1序列区内TTV分离株与N22相比存在7个相对较高的核酸突变点，但分离株之间上述位置核酸基本相同，说明在一定的时间及区域内，TTV存在变异，但相对保守。
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参考文献
1，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology. Research,1998,10(1):1～16.
2，周育森，何忠平，懂京芳，等. 中国人TTV部分基因克隆及序列测定. 军事医学科学院院刊，1998，22(2)：81～83.
(修回日期：2000-05-24), 百拇医药
单位：李体远 戴勇 周伯平(518020 深圳市东湖医院)；孙彤(100071 北京市，中国军事医学科学院微生物研究所)
关键词：肝炎病毒；变异(遗传学)；基因型；序列分析；TT病毒
实用医学杂志000910 摘 要 目的：探讨深圳地区流行TTV病毒的主要基因型、基因变异状况。方法：采集长期维持性血液透析患者，以及非甲-非庚但血清ALT升高肝炎患者血清标本，提取病毒DNA后，巢式PCR扩增TTV ORF1部分基因，克隆、测序后，进行基因分型及基因变异分析。结果：对21例TTV ORF1部分基因进行序列分析，基因同源性为60.3%～98.5%。21例TTV分离株中，G1型17例，其中，G1a亚型16例，G1b亚型1例；G2型4例，其中G2a亚型0例，G2b亚型3例，另一例可能为新的亚型，命名为G2x。结论：深圳地区血液透析患者及非甲-非庚、但血清ALT升高患者流行TTV病毒的基因型主要为G1a亚型。TTV基因变异可达39.7%。
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TT病毒(transfusion transmitted virus，TTV)是日本科学家新近发现的一种可致人类肝炎的嗜肝病毒[1]，国内学者对此亦进行了研究[2]。我们对20余例TTV分离株进行了研究，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 血清标本分别采自深圳市四家大医院维持性血液透析患者(70例)，以及非甲-非庚、但血清ALT升高患者(10例)共计80例。血液透析患者中，原发病为慢性肾炎31例，糖尿病肾病9例、高血压肾病5例，其他为梗阻性肾病、肾移植术后排异、肾结核、多囊肾等共计25例，部分患者有输血史。巢式PCR扩增TTV DNA，将其中21例PCR阳性产物克隆、测序分析，分别命名为T1～T21。
1.2 标本处理 采集维持性血液透析患者透析前静脉血或非甲-非庚患者空腹静脉血5 ml，3 000 r/min离心分离血清。
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1.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTPs、低熔点琼脂糖购至Promega公司。质粒PUC 19等为Boeringer Mannerim公司产品。
1.4 TTV DNA的扩增 参照N22基因序列，设计两对TTV ORF1保守区巢式引物：P1 5′-ACAGACAGAG-GAGAAGGCAAC-3′，P2 5′-GGATACCTATTAGCTCTCAT
-3′，P3 5′-GGCAACATGTTATGGATAGAC-3′，P4 5′-CCTGGCATTTTACCATTTCCA-3’，其中，P1，P2为上、下游外引物，P3，P4为上、下游内引物，内引物扩增产物长272 bp。提取血清标本DNA，巢式PCR扩增。扩增条件：94℃ 40 s，56℃ 35 s，72℃ 45 s，共循环30次，最后72℃延伸7 min。进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物出现272 bp DNA条带视为阳性。
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1.5 TTV PCR产物的克隆及序列分析 低溶点琼脂糖法回收第2次PCR产物，插入质粒PUC，筛选阳性克隆。碱裂解法提取质粒，用通用引物双向测序。
1.6 DNA序列同源性比较 采用Goldkey软件(军事科学院)进行DNA序列分析，并与国外报道序列进行同源性比较。
1.7 TTV基因分型 根据Okamoto等[1]报道的分型标准，TTV型与型之间核酸同源性小于70%，亚型与亚型之间核酸变异为11%～15%。
2 结果
2.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 阳性标本扩增物可见272 bpDNA条带，与预期大小相同。
2.2 TTV DNA序列分析 对21例TTV分离株进行测序分析，结果见图1。
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2.3 TTV分离株同源性比较 对TTV各分离株核酸序列进行同源性分析，结果其同源性为60.3%～98.5%。
2.4 TTV分离株基因分型 11例血透患者中有10例均为G1a亚型，另1例由于与TS003及NA004的同源性仅分别为78.3%及70.2%，可能为新的亚型，我们将其命名为G2x。10例非甲-非庚肝炎TTV阳性患者中，G1a 6例，G1b 1例，G2b 3例。
2.5 TTV基因变异分析 与N22分离株相比较，在16例均属G1a亚型的分离株中，在扩增的ORF1序列区内，共有7个相对较高的突变点，分别位于nt1983，1987，1993，2027，2058，2116，2151。
3 讨论
由于血清中TTV病毒滴度不高且差异较大(102～104)，对TTV的扩增均采用巢式或半巢式PCR方法进行。所用PCR引物区段不同，病毒DNA提取方法的差异，或者PCR条件的变化，加上病毒自身的变异，都可能导致漏检。因此，研究我国不同人群、不同地域流行TTV的基因类型及基因变异状况，对于建立TTV特异检测方法，了解TTV的临床和流行病学特征，探索TTV的致病性，开发TTV疫苗，都具有重要意义。目前多用TTV ORF1区序列设计引物进行检测。有人在TTV ORF2区设计PCR引物，检出率相对不高。我们分别检测了非甲-非庚肝炎患者及肝炎病毒传播高危人群-血液透析患者中TTV感染状况，TTV ORF1 DNA检出率为35%(28/80)。
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注：T1～T21为TTV分离株，SZ1为文献报道的深圳分离株，N22，TX011，NA004及
TS003为日本分离株
图1 21例TTV分离株序列分析
到目前为止，有关TTV基因变异的资料不多。我们对检出的21株TTV分离株进行同源性分析，其核酸变异可达39.7%(同源性60.3%～98.5%)。依据Okamoto的基因分型方法，我们的结果提示，深圳地区流行的TTV基因型与日本有所不同，主要为G1a和G2b，而后者为G1a和G2a，且G2型TTV甚少，在检测的78例中仅有2例。在我们检测的21例TTV分离株中，G1a 16例、G1b 1例、G2a 0例，G2b 3例。分离株T11与NS 003序列同源性最高，但也仅有78.3%，故暂将其定为G2x亚型。在扩增的ORF1序列区内TTV分离株与N22相比存在7个相对较高的核酸突变点，但分离株之间上述位置核酸基本相同，说明在一定的时间及区域内，TTV存在变异，但相对保守。
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参考文献
1，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology. Research,1998,10(1):1～16.
2，周育森，何忠平，懂京芳，等. 中国人TTV部分基因克隆及序列测定. 军事医学科学院院刊，1998，22(2)：81～83.
(修回日期：2000-05-24), 百拇医药