Fos蛋白在血管加压素诱发急性心肌缺血大鼠脑内的分布
作者：葛煦 宿长军 饶志仁 高文
单位：葛煦(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；宿长军(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；饶志仁(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；高文(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)
关键词：Fos蛋白；心肌缺血；血管加压素；免疫组织化学；大鼠
解剖学报000403 【摘要】 目的 研究与急性心肌缺血功能有关的神经元在大鼠脑内的分布。 方法 股静脉注射血管加压素诱发大鼠急性心肌缺血，用免疫组织化学ABC法，观察Fos蛋白在脑内的表达和分布。 结果 Fos阳性产物分布于梨状皮质、伏核、终纹床核、扣带回、斜角带核、下丘脑室旁核、视上核、视交叉上核、弓状核、中央杏仁核、穹窿下器、丘脑室旁核、外侧缰核、中脑中央灰质腹外侧区、脑桥臂旁外侧核、蓝斑、延髓内脏带等脑区，而在大脑白质及小脑中无明显的密集分布区。 结论 心肌缺血诱发的Fos阳性神经元在大鼠脑内有着广泛的分布。
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【中图分类号】 R322.81 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-296
DISTRIBUTION OF FOS PROTEIN IN RAT BRAIN FOLLOWING
ACUTE MYOCARDIOISCHEMIA INDUCED BY VASOPRESSIN
GE Xu SU Chang-jun RAO Zhi-ren GAO Wen
(Institute of Neurosciences,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
【Abstract】 Objective
, 百拇医药
To investigate the distribution of functional neurons in rat brain following acute myocardioischemia. Methods The expression of Fos protein in rat brain following acute myocardioischemia induced by injecting vasopressin into vena femoralis was studied by the immunohistochemical ABC method. Results The Fos reactive products were distributed in the piriform cortex,accumbens nucleus,bed nucleus of stria terminalis, cingulate gyrus,nucleus of diagonal band, hypothalamic paraventricular nucleus, supraoptic nucleus, suprachiasmatic nucleus, arcuate nucleus, central amygdaloid, subfornical organ, paraventricular thalamic nucleus, lateral habenular nucleus,ventrolateral part of the central gray,lateral parabrachial nucleus,locus ceruleus,medullary visceral zone.No extensively distribution of Fos protein was found in the white matter and the cerebellum. Conclusion The Fos reactive neurons were distributed extensively in the rat brain during acute myocardioischemia induced by intravenous injection of vasopressin.
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【Key words】 Fos; Myocardioischemia; Vasopressin; Immunohistochemistry;Rat
早期即刻原癌基因c-fos被认为是神经元的一种“第三信使”，当细胞受到刺激时，第二信使进入胞核诱导c-fos基因转录mRNA，mRNA从胞核进入胞浆合成Fos蛋白，Fos蛋白与Jun蛋白结合形成二聚体，磷酸化并在AP-1的参与下进入胞核激活目的基因的表达并最终对该刺激做出反应[1]。用原位杂交方法可观察胞浆内的mRNA，免疫组织化学方法则可显示胞核内的Fos蛋白，借以辨别与刺激有关的功能神经元，了解其生理功能和形态结构间的关系。Fos方法已成为目前最常用的机能形态学方法之一。
心肌缺血是临床的常见病，严重者可发生心绞痛、心肌梗塞等病变，与高血压一起严重影响着人类的生存质量。尽管其诊断和治疗已有多种方案，且效果较好，但其神经调控机制仍不清楚，与其相关的功能系神经元分布亦缺乏详尽报道。本实验以股静脉注射血管加压素诱发急性心肌缺血的大鼠为动物模型，采用免疫组织化学方法，观察了Fos蛋白在脑中的分布。
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材料和方法
1. 动物模型及切片制备
雄性SD大鼠6只，体重180～250g，在温暖、避光、水和食物充足的环境中饲养1周后，乙醚吸入结合1%戊巴比妥钠(40mg/kg体重)腹腔麻醉以减少注射过程中因疼痛挣扎而出现的Fos表达，并记录心电图(ECG)。暴露股静脉，分3次注入血管加压素，每次1U，间隔10min,再次记录ECG，并在动物存活2h后开胸，升主动脉插管。先以100ml生理盐水快速冲洗血液，随后用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)灌流固定，取出全脑置于20%蔗糖中至沉底。冰冻切片机切制连续冠状切片，片厚30μm。
2. 免疫组织化学染色
按ABC法进行。切片入含0.3% Triton X-100的PBS中室温浸泡30min,0.01mol/L PBS漂洗10min×3次后，于兔抗Fos多克隆抗体(1∶3 000,Santa Cruz)中4℃放置48h，PBS漂洗10min×3次后入生物素结合的羊抗兔IgG(1∶500，Sigma)，室温放置2h，再次漂洗后移至Avidin-Biotin HRP Complex-ABC液(1∶500，Sigma)中室温2h，硫酸镍胺-葡萄糖氧化酶法呈色。常规贴片、脱水透明、DPX封片，光镜观察。
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3. 对照实验
3.1 麻醉对照组：SD大鼠4只，乙醚吸入麻醉后，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg体重)，不手术，不注射血管加压素，2h后同前灌流固定、取材、进行Fos免疫组织化学反应。
3.2 生理盐水对照组：SD大鼠4只，乙醚-戊巴比妥钠复合麻醉下，生理盐水替代血管加压素以同等方式、同等剂量注入股静脉，测量ECG，其后步骤同实验组。
3.3 免疫组织化学法对照：用PBS取代兔抗Fos多克隆抗体，将部分实验组切片孵育48h(4℃)，其他步骤同实验组。
结果
文中所用核团的中英文名称参照王平宇等的研究[2]。
1. 心电图改变
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实验组注射血管加压素前心电图无明显改变(图1a)：注射后，心电图示ST-T段持续改变，提示心肌缺血，且心率增快(图1b)。生理盐水对照组心电图无缺血改变。
图1a 注射血管加压素前大鼠的心电图；
1b 注射血管加压素后大鼠的心电图，示心肌缺血
Fig.1a Electrocardiogram(ECG) of the rat without being
injected the vasopressin; 1b,ECG of the rat being
injected the vasopressin indicated myocardioischemia.
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2. Fos阳性胞核分布
在血管加压素诱发急性心肌缺血情况下，Fos阳性胞核见于大鼠脑内多个核团和区域(图2)，现分述如下：
2.1 大脑：嗅脑内Fos阳性细胞主要出现在小球层和僧帽细胞层，此外髓层中也有较密集的分布。
皮质区除扣带回、梨状皮质有Fos阳性细胞中度密集的分布外，其余皮质均很稀少。
此外，伏核、终纹床核(图3)、斜角带核(图4)、Calleja岛、杏仁核簇，尤其是中央杏仁核(图5)、穹窿下器周缘(图6)皆有密集分布。
2.2 间脑：下丘脑区域Fos阳性产物密集于下丘脑室旁核(图7)、视上核(图8)、视交叉上核(图9)、弓状核(图10)和正中隆起。第三脑室室周灰质、下丘脑视前外侧区和外侧区也有Fos阳性细胞的中度密集分布。
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丘脑室旁核、外侧缰核(图11)Fos分布密集。
2.3 小脑：急性心肌缺血时，大鼠小脑内Fos阳性产物无明显分布密集区。
图2 大鼠脑内Fos蛋白的分布示意图
(A～K示吻侧-尾侧的不同冠状切面)
3.动眼神经核 7.面神经核 10.迷走神经背核 12.舌下神经核 A5.脑桥A5区 ac.前连合 ACB.伏核 Arc.弓状核 BL.杏仁基外侧核 BM.杏仁基内侧核 Ce.中央杏仁核 CVL.腹外侧网状核 DM.下丘脑背内侧核 DR.中缝背核 DTg.背盖背侧核 Gl.小球层 HDB.斜角带核水平部 ICj.Calleja岛 IO.下橄榄核 k.下橄榄内侧核帽 IRt.中间带 LC.蓝斑 LH.下丘脑外侧区 LHB.外侧缰核 LRt.外侧网状核 LVe.前庭外侧核 Me.杏仁内侧核 MHb.内侧缰核 Mi.僧帽细胞层 MP.乳头体内侧核后部MS.隔内侧核 MVe.前庭内侧核 nA.疑核 nSp5.三叉神经脊束核 NTS.孤束核 opt.视束 Pa5.三叉旁核 PaV.下丘脑室旁核 PBL.臂旁外侧核 Pe.下丘脑室周核 Pir.梨状皮质 Pn.桥核 PrH.舌下神经前置核 PV.丘脑室旁核 ROb.中缝隐核 SO.视交叉上核SpVe.前庭脊核 SuVe.前庭上核 VDB.斜角带核垂直部 VMH.下丘脑腹内侧核
, 百拇医药
Fig.2 Distribution of Fos protein in the rat brain
(A-K showed the different coronary plane from rostral to caudal).
3,oculomotor nucleus 7,facial nucleus 10,dorsal nucleus of vagus nerve 12,hypoglossal nucleus A5,pontine A5 area ac,anterior commissure ACB,accumbens nucleus Arc,arcuate hypothalamic nucleus BL,basolateral amygdaloid nucleus BM,basomedial amygdaloid nucleus Ce,central amygdaloid nucleus CVL,ventrolateral reticular nucleus DM,dorsomedial hypothalamic nucleus DR,dorsal raphe nucleus DTg,dorsal tegmental nucleus Gl,glomerular layer of the olfactery bulb HDB,horizontal part of diagonal band nucleus ICj,islands of Calleja IO,inferior olivary nucleus k,cap of medial nucleus of IO IRt,intermediate reticular nucleus LC,locus ceruleus LH,lateral hypothalamic area LHb,lateral habenular nucleus LRt,lateral reticular nucleus LVe,lateral vestibular nucleus Me,medial amygdaloid nucleus MHb,medial habenular nucleus Mi,mitral cell layer of the olfactory bulb MP,posterior part of medial mammillary nucleus MS,medial septal nucleus MVe,medial vestibular nucleus nA,nucleus ambiguus nSp5,spinal nucleus of trigeminal nerve NTS,nucleus of solitary tract opt,optic tract Pa5,paratrigeminal nucleus PaV,paraventricular hypothalamic nucleus PBL,lateral barabrachial nucleus Pe,periventricular hypothalamic nucleus Pir,piriform cortex Pn,potine nucleus PrH,prepositus hypoglossal nucleus PV,paraventricular thalamic nucleus ROb,raphe obscurus nucleus SO,supraoptic nucleus SpVe,spinal vesticular nucleus SuVe,superior vesticular nucleus VDB,vertical part of diagonal band nucleus VMH,ventromedial hypothalamic nucleus
, 百拇医药
2.4 脑干：中脑中央灰质的腹外侧区(图12)、中缝背核Fos阳性产物中度密集。
脑桥臂旁外侧核、蓝斑(图13)和A5区有高度密集的Fos分布，背侧背盖区中度密集，前庭核簇、中缝核群也有少量分布。
Fos阳性产物在延髓内的分布极具规律性，密集区形成一条背内腹外方向伸展的弧形带，称为延髓内脏带(MVZ)。具体包括：背内侧的孤束核、迷走神经背核、最后区、腹外侧的腹外侧网状核以及位于两者之间的中间带等(图14)。值得注意的是在MVZ中间部Fos阳性胞核多位于疑核内侧。此外，三叉神经旁核、下橄榄内侧核帽也有中等程度的Fos表达。
3. 实验组和对照组不同核团中Fos阳性产物的定量比较(附表)
从表中数据可看出，除嗅脑外，实验组和对照组Fos阳性胞核在大鼠脑内不同核团中的数量有显著的差异。
, 百拇医药
附表 Fos阳性产物在实验组及对照组大鼠脑内不同核团中的分布
Table Distribution of the Fos positive reactive products in the rat brains of the experimental group and the control groups
实验组
experimental
group
麻醉对照
anesthesia
group
盐水对照
, 百拇医药
saline
group
实验组
experimental
group
麻醉对照
anesthesia
group
盐水对照
saline
group
嗅脑
rhinencephalon
, http://www.100md.com
532
510
547
外侧缰核
lateral habenular nucleus
75
20
12
梨状皮质piriform cortex
63
31
41
, 百拇医药 外侧臂旁核lateral parabrachial nucleus
224
21
36
扣带回
cingulum gyrus
109
37
43
中央灰质腹外侧区
ventrolateral part of the central gray
, http://www.100md.com 95
20
25
终纹床核
bed nucleus of stria terminals
45
5
17
蓝斑
locus ceruleus
90
16
44
, 百拇医药
斜角带
nucleus of diagonal band
316
56
92
中缝背核
dorsal raphe nucleus
45
3
4
中央杏仁核
central amygdaloid
, http://www.100md.com
90
3
7
最后区
area postrema
265
20
15
穹窿下器
subfornical organ
121
9
21
, 百拇医药
孤束核
nucleus of solitary tract
768
70
260
视上核
supraoptic nucleus
168
40
32
中间带
intermediate reticular zone
, 百拇医药
55
10
15
视交叉上核
suprachiasmatic nucleus
80
6
17
疑核
nucleus ambiguus
15
3
5
, 百拇医药
下丘脑室旁核
hypothalamic paraventricular nucleus
76
30
26
腹外侧网状核
ventrolateral reticular nucleus
75
10
25
讨论
血管加压素是一种九肽，由下丘脑室旁核和视上核神经元分泌，经下丘脑垂体束被运输到垂体后叶，并作为垂体后叶激素释放入血。起初人们以为血管加压素的生理功能是促进肾脏对水的重吸收，故称之为抗利尿激素。但后来知道它对心血管活动也起重要的调节作用。
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由于血管加压素的作用主要针对内脏小动脉，且一般不能通过血脑屏障，故可以排除其直接作用于中枢神经系统的影响。心脏是对缺血最敏感的器官，本实验从股静脉注入血管加压素[3]，引起大鼠冠状动脉等血管的痉挛，造成急性心肌供血不足，加之外周阻力增加，导致心脏负荷加重，直接表现为心电图的缺血改变。这种来自心脏的缺血信息很快传入中枢，在中枢神经系统经过一系列的整合与调节，产生相应的应激反应。这种整合及调节的过程非常复杂，由多级中枢共同参与。
Fos方法自80年代建立以来，已广泛用于显示某一刺激传导的神经通路[4～6]，虽然其结果是通过形态学方法显示，但在某种程度上反映了一定的功能意义，因而被认为是一种形态与功能相结合的指标[3]。在使用Fos法时，我们除严格限制实验条件外，还设立了严格的对照，以保证结果的特异性。对于嗅脑Fos分布在实验组和对照组无明显差异的结果，我们认为与乙醚吸入麻醉有关，嗅皮质对急性心肌缺血似无直接反应。
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Dun[7]在研究心血管反应相关神经元时发现：失血刺激下，Fos阳性产物见于梨状皮质、终纹床核、Calleja核、穹窿下器、杏仁中央核、臂旁核、室旁核、视上核、脑桥A5区、延髓腹外侧部、孤束核、最后区以及脊髓中间带外侧核等；而高血压条件下，则主要密集于终纹床核、杏仁中央核、臂旁核、孤束核和最后区。Vahid-Ansari[8]的研究则表明：急性心肌梗死引起的充血性心力衰竭在发生2～4周后Fos相关基因样(Fra-LI)物质主要见于室旁核、视上核、孤束核、迷走神经背核、最后区，腹外侧的腹外侧网状核以及位于两者之间的中间带等核团。我们在血管加压素诱发急性心肌缺血状态下得到的实验结果基本上包括了以上核团，此外还证实了斜角带核、蓝斑、延髓中间网状等也参与心血管反应。
根据以往的研究[9]推测，上述核团的反应不是彼此孤立，而是构成以延髓内脏带为中心的神经网络。来自内脏的刺激信息经迷走神经或交感神经的传入纤维直接或间接(经脊髓)传至延髓内脏带，延髓内脏带的相关神经元发出纤维直接[10，11]或间接[12](经臂旁核、中脑中央灰质换元)投射至前脑边缘系(梨状皮质、终纹床核、杏仁中央核等)和下丘脑[13](室旁核、视上核等)。前脑边缘系和下丘脑也发出纤维直接或间接(经臂旁核、中脑中央灰质换元)投射至延髓内脏带，延髓内脏带也有纤维投射至脊髓中间带外侧核(交感神经节前神经元)或发出副交感节前纤维支配心脏。由此可见，当急性心肌缺血时，机体的应激反应是受到一个复杂的中枢神经网络的调节。
, 百拇医药
本文图3～14见插图第3，4页
图3 终纹床核内的Fos阳性神经元。BST.终纹床核 LV.侧脑室 ×400
Fig.3 Fos-positive neurons in the bed nucleus of stria terminalis.BST, bed nucleus or stria terminalis LV,lateral ventricle ×400
图4 斜角带核内的Fos阳性神经元。HDB.斜角带核水平部 VDB.斜角带核垂直部 ×160
Fig.4 Fos-positive neurons in the nucleus of diagonal band.HDB,horizontal part of the nucleus of diagonal band VDB,vertical part of the nucleus of diagonal band ×160
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图5 杏仁核簇内的Fos阳性神经元。OPT.视束 CE.杏仁中央核 ×160
Fig.5 Fos-positive neurons in the amygdaloid nuclei.OPT,optic tract CE,central amygdaloid nuclei ×160
图6 穹窿下器内的Fos阳性神经元。SFO.穹窿下器 ×160
Fig.6 Fos-positive neurons in the subfornical organ. SFO,subfornical organ ×160
图7 下丘脑室旁核的Fos阳性神经元。3V.第三脑室 PA.下丘脑室旁核 ×400
, 百拇医药
Fig.7 Fos-positive neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus.3V,3th ventrical PA,hypothalamic paraventricular nucleus ×400
图8 视上核内的Fos阳性神经元。OPT.视束 SO.视上核 ×160
Fig.8 Fos-positive neurons in the supraoptic nucleus.OPT,optic tract SO,supraoptic nucleus ×160
图9 视交叉上核的Fos阳性神经元。3V.第三脑室 SCH.视交叉上核 ×400
, 百拇医药
Fig.9 Fos-positive neurons in the suprachiasmatic nucleus.3V,3th ventrical SCH,suprachiasmatic nucleus ×400
图10 弓状核的Fos阳性神经元。ARC.弓状核 ×160
Fig.10 Fos-positive neurons in the arcuate nucleus.3V,3th ventrical ARC,arcuate nucleus ×160
图11 外侧缰核的Fos阳性神经元。3V.第三脑室 LHB.外侧缰核 ×160
, 百拇医药
Fig.11 Fos-positive neurons in the lateral habenular nucleus.3V,3th ventrical LHB,lateral habenular nucleus ×160
图12 中脑中央灰质腹外侧区的Fos阳性神经元。AQ.中脑导水管 CGL.中脑中央灰质外侧区 ×160
Fig.12 Fos-positive neurons in the ventrolateral part of central gray.AQ,mesencephalic aqueduct CGL,lateral part of central gray ×160
, 百拇医药 图13 臂旁外侧核及蓝斑内的Fos阳性神经元。LC.蓝斑 LPB.臂旁外侧核 ×160
Fig.13 Fos-positive neurons in the lateral parabrachial nucleus and locus ceruleus.LC,locus ceruleus LHB,lateral parabrachial nucleus ×160
图14 延髓内脏带中的Fos阳性神经元。AP.最后区 NTS.孤束核 VLRT.腹外侧网状核 ×80
Fig.14 Fos-positive neurons in the medullary visceral zone.AP,area postrema. NTS,nucleus of solitary tract VLRT,ventrolateral reticular nucleus ×80
, 百拇医药
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39770251)
【作者简介】 葛煦(1973—)，男(汉族)，四川成都人，硕士
参考文献
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[10]陈良为，饶志仁，施继武.大鼠“延髓内脏带”向杏仁核投射的儿茶酚胺能神经元对内脏伤害性刺激的Fos表达[J].神经解剖学杂志，1994，10(2)：139～144.
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【收稿日期】 1999-04-23
【修回日期】 1999-12-14, http://www.100md.com
单位：葛煦(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；宿长军(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；饶志仁(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；高文(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)
关键词：Fos蛋白；心肌缺血；血管加压素；免疫组织化学；大鼠
解剖学报000403 【摘要】 目的 研究与急性心肌缺血功能有关的神经元在大鼠脑内的分布。 方法 股静脉注射血管加压素诱发大鼠急性心肌缺血，用免疫组织化学ABC法，观察Fos蛋白在脑内的表达和分布。 结果 Fos阳性产物分布于梨状皮质、伏核、终纹床核、扣带回、斜角带核、下丘脑室旁核、视上核、视交叉上核、弓状核、中央杏仁核、穹窿下器、丘脑室旁核、外侧缰核、中脑中央灰质腹外侧区、脑桥臂旁外侧核、蓝斑、延髓内脏带等脑区，而在大脑白质及小脑中无明显的密集分布区。 结论 心肌缺血诱发的Fos阳性神经元在大鼠脑内有着广泛的分布。
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【中图分类号】 R322.81 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-296
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ACUTE MYOCARDIOISCHEMIA INDUCED BY VASOPRESSIN
GE Xu SU Chang-jun RAO Zhi-ren GAO Wen
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【Abstract】 Objective
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To investigate the distribution of functional neurons in rat brain following acute myocardioischemia. Methods The expression of Fos protein in rat brain following acute myocardioischemia induced by injecting vasopressin into vena femoralis was studied by the immunohistochemical ABC method. Results The Fos reactive products were distributed in the piriform cortex,accumbens nucleus,bed nucleus of stria terminalis, cingulate gyrus,nucleus of diagonal band, hypothalamic paraventricular nucleus, supraoptic nucleus, suprachiasmatic nucleus, arcuate nucleus, central amygdaloid, subfornical organ, paraventricular thalamic nucleus, lateral habenular nucleus,ventrolateral part of the central gray,lateral parabrachial nucleus,locus ceruleus,medullary visceral zone.No extensively distribution of Fos protein was found in the white matter and the cerebellum. Conclusion The Fos reactive neurons were distributed extensively in the rat brain during acute myocardioischemia induced by intravenous injection of vasopressin.
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【Key words】 Fos; Myocardioischemia; Vasopressin; Immunohistochemistry;Rat
早期即刻原癌基因c-fos被认为是神经元的一种“第三信使”，当细胞受到刺激时，第二信使进入胞核诱导c-fos基因转录mRNA，mRNA从胞核进入胞浆合成Fos蛋白，Fos蛋白与Jun蛋白结合形成二聚体，磷酸化并在AP-1的参与下进入胞核激活目的基因的表达并最终对该刺激做出反应[1]。用原位杂交方法可观察胞浆内的mRNA，免疫组织化学方法则可显示胞核内的Fos蛋白，借以辨别与刺激有关的功能神经元，了解其生理功能和形态结构间的关系。Fos方法已成为目前最常用的机能形态学方法之一。
心肌缺血是临床的常见病，严重者可发生心绞痛、心肌梗塞等病变，与高血压一起严重影响着人类的生存质量。尽管其诊断和治疗已有多种方案，且效果较好，但其神经调控机制仍不清楚，与其相关的功能系神经元分布亦缺乏详尽报道。本实验以股静脉注射血管加压素诱发急性心肌缺血的大鼠为动物模型，采用免疫组织化学方法，观察了Fos蛋白在脑中的分布。
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材料和方法
1. 动物模型及切片制备
雄性SD大鼠6只，体重180～250g，在温暖、避光、水和食物充足的环境中饲养1周后，乙醚吸入结合1%戊巴比妥钠(40mg/kg体重)腹腔麻醉以减少注射过程中因疼痛挣扎而出现的Fos表达，并记录心电图(ECG)。暴露股静脉，分3次注入血管加压素，每次1U，间隔10min,再次记录ECG，并在动物存活2h后开胸，升主动脉插管。先以100ml生理盐水快速冲洗血液，随后用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)灌流固定，取出全脑置于20%蔗糖中至沉底。冰冻切片机切制连续冠状切片，片厚30μm。
2. 免疫组织化学染色
按ABC法进行。切片入含0.3% Triton X-100的PBS中室温浸泡30min,0.01mol/L PBS漂洗10min×3次后，于兔抗Fos多克隆抗体(1∶3 000,Santa Cruz)中4℃放置48h，PBS漂洗10min×3次后入生物素结合的羊抗兔IgG(1∶500，Sigma)，室温放置2h，再次漂洗后移至Avidin-Biotin HRP Complex-ABC液(1∶500，Sigma)中室温2h，硫酸镍胺-葡萄糖氧化酶法呈色。常规贴片、脱水透明、DPX封片，光镜观察。
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3. 对照实验
3.1 麻醉对照组：SD大鼠4只，乙醚吸入麻醉后，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg体重)，不手术，不注射血管加压素，2h后同前灌流固定、取材、进行Fos免疫组织化学反应。
3.2 生理盐水对照组：SD大鼠4只，乙醚-戊巴比妥钠复合麻醉下，生理盐水替代血管加压素以同等方式、同等剂量注入股静脉，测量ECG，其后步骤同实验组。
3.3 免疫组织化学法对照：用PBS取代兔抗Fos多克隆抗体，将部分实验组切片孵育48h(4℃)，其他步骤同实验组。
结果
文中所用核团的中英文名称参照王平宇等的研究[2]。
1. 心电图改变
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实验组注射血管加压素前心电图无明显改变(图1a)：注射后，心电图示ST-T段持续改变，提示心肌缺血，且心率增快(图1b)。生理盐水对照组心电图无缺血改变。
图1a 注射血管加压素前大鼠的心电图；
1b 注射血管加压素后大鼠的心电图，示心肌缺血
Fig.1a Electrocardiogram(ECG) of the rat without being
injected the vasopressin; 1b,ECG of the rat being
injected the vasopressin indicated myocardioischemia.
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2. Fos阳性胞核分布
在血管加压素诱发急性心肌缺血情况下，Fos阳性胞核见于大鼠脑内多个核团和区域(图2)，现分述如下：
2.1 大脑：嗅脑内Fos阳性细胞主要出现在小球层和僧帽细胞层，此外髓层中也有较密集的分布。
皮质区除扣带回、梨状皮质有Fos阳性细胞中度密集的分布外，其余皮质均很稀少。
此外，伏核、终纹床核(图3)、斜角带核(图4)、Calleja岛、杏仁核簇，尤其是中央杏仁核(图5)、穹窿下器周缘(图6)皆有密集分布。
2.2 间脑：下丘脑区域Fos阳性产物密集于下丘脑室旁核(图7)、视上核(图8)、视交叉上核(图9)、弓状核(图10)和正中隆起。第三脑室室周灰质、下丘脑视前外侧区和外侧区也有Fos阳性细胞的中度密集分布。
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丘脑室旁核、外侧缰核(图11)Fos分布密集。
2.3 小脑：急性心肌缺血时，大鼠小脑内Fos阳性产物无明显分布密集区。
图2 大鼠脑内Fos蛋白的分布示意图
(A～K示吻侧-尾侧的不同冠状切面)
3.动眼神经核 7.面神经核 10.迷走神经背核 12.舌下神经核 A5.脑桥A5区 ac.前连合 ACB.伏核 Arc.弓状核 BL.杏仁基外侧核 BM.杏仁基内侧核 Ce.中央杏仁核 CVL.腹外侧网状核 DM.下丘脑背内侧核 DR.中缝背核 DTg.背盖背侧核 Gl.小球层 HDB.斜角带核水平部 ICj.Calleja岛 IO.下橄榄核 k.下橄榄内侧核帽 IRt.中间带 LC.蓝斑 LH.下丘脑外侧区 LHB.外侧缰核 LRt.外侧网状核 LVe.前庭外侧核 Me.杏仁内侧核 MHb.内侧缰核 Mi.僧帽细胞层 MP.乳头体内侧核后部MS.隔内侧核 MVe.前庭内侧核 nA.疑核 nSp5.三叉神经脊束核 NTS.孤束核 opt.视束 Pa5.三叉旁核 PaV.下丘脑室旁核 PBL.臂旁外侧核 Pe.下丘脑室周核 Pir.梨状皮质 Pn.桥核 PrH.舌下神经前置核 PV.丘脑室旁核 ROb.中缝隐核 SO.视交叉上核SpVe.前庭脊核 SuVe.前庭上核 VDB.斜角带核垂直部 VMH.下丘脑腹内侧核
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Fig.2 Distribution of Fos protein in the rat brain
(A-K showed the different coronary plane from rostral to caudal).
3,oculomotor nucleus 7,facial nucleus 10,dorsal nucleus of vagus nerve 12,hypoglossal nucleus A5,pontine A5 area ac,anterior commissure ACB,accumbens nucleus Arc,arcuate hypothalamic nucleus BL,basolateral amygdaloid nucleus BM,basomedial amygdaloid nucleus Ce,central amygdaloid nucleus CVL,ventrolateral reticular nucleus DM,dorsomedial hypothalamic nucleus DR,dorsal raphe nucleus DTg,dorsal tegmental nucleus Gl,glomerular layer of the olfactery bulb HDB,horizontal part of diagonal band nucleus ICj,islands of Calleja IO,inferior olivary nucleus k,cap of medial nucleus of IO IRt,intermediate reticular nucleus LC,locus ceruleus LH,lateral hypothalamic area LHb,lateral habenular nucleus LRt,lateral reticular nucleus LVe,lateral vestibular nucleus Me,medial amygdaloid nucleus MHb,medial habenular nucleus Mi,mitral cell layer of the olfactory bulb MP,posterior part of medial mammillary nucleus MS,medial septal nucleus MVe,medial vestibular nucleus nA,nucleus ambiguus nSp5,spinal nucleus of trigeminal nerve NTS,nucleus of solitary tract opt,optic tract Pa5,paratrigeminal nucleus PaV,paraventricular hypothalamic nucleus PBL,lateral barabrachial nucleus Pe,periventricular hypothalamic nucleus Pir,piriform cortex Pn,potine nucleus PrH,prepositus hypoglossal nucleus PV,paraventricular thalamic nucleus ROb,raphe obscurus nucleus SO,supraoptic nucleus SpVe,spinal vesticular nucleus SuVe,superior vesticular nucleus VDB,vertical part of diagonal band nucleus VMH,ventromedial hypothalamic nucleus
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2.4 脑干：中脑中央灰质的腹外侧区(图12)、中缝背核Fos阳性产物中度密集。
脑桥臂旁外侧核、蓝斑(图13)和A5区有高度密集的Fos分布，背侧背盖区中度密集，前庭核簇、中缝核群也有少量分布。
Fos阳性产物在延髓内的分布极具规律性，密集区形成一条背内腹外方向伸展的弧形带，称为延髓内脏带(MVZ)。具体包括：背内侧的孤束核、迷走神经背核、最后区、腹外侧的腹外侧网状核以及位于两者之间的中间带等(图14)。值得注意的是在MVZ中间部Fos阳性胞核多位于疑核内侧。此外，三叉神经旁核、下橄榄内侧核帽也有中等程度的Fos表达。
3. 实验组和对照组不同核团中Fos阳性产物的定量比较(附表)
从表中数据可看出，除嗅脑外，实验组和对照组Fos阳性胞核在大鼠脑内不同核团中的数量有显著的差异。
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附表 Fos阳性产物在实验组及对照组大鼠脑内不同核团中的分布
Table Distribution of the Fos positive reactive products in the rat brains of the experimental group and the control groups
实验组
experimental
group
麻醉对照
anesthesia
group
盐水对照
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saline
group
实验组
experimental
group
麻醉对照
anesthesia
group
盐水对照
saline
group
嗅脑
rhinencephalon
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532
510
547
外侧缰核
lateral habenular nucleus
75
20
12
梨状皮质piriform cortex
63
31
41
, 百拇医药 外侧臂旁核lateral parabrachial nucleus
224
21
36
扣带回
cingulum gyrus
109
37
43
中央灰质腹外侧区
ventrolateral part of the central gray
, http://www.100md.com 95
20
25
终纹床核
bed nucleus of stria terminals
45
5
17
蓝斑
locus ceruleus
90
16
44
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斜角带
nucleus of diagonal band
316
56
92
中缝背核
dorsal raphe nucleus
45
3
4
中央杏仁核
central amygdaloid
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90
3
7
最后区
area postrema
265
20
15
穹窿下器
subfornical organ
121
9
21
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孤束核
nucleus of solitary tract
768
70
260
视上核
supraoptic nucleus
168
40
32
中间带
intermediate reticular zone
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55
10
15
视交叉上核
suprachiasmatic nucleus
80
6
17
疑核
nucleus ambiguus
15
3
5
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下丘脑室旁核
hypothalamic paraventricular nucleus
76
30
26
腹外侧网状核
ventrolateral reticular nucleus
75
10
25
讨论
血管加压素是一种九肽，由下丘脑室旁核和视上核神经元分泌，经下丘脑垂体束被运输到垂体后叶，并作为垂体后叶激素释放入血。起初人们以为血管加压素的生理功能是促进肾脏对水的重吸收，故称之为抗利尿激素。但后来知道它对心血管活动也起重要的调节作用。
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由于血管加压素的作用主要针对内脏小动脉，且一般不能通过血脑屏障，故可以排除其直接作用于中枢神经系统的影响。心脏是对缺血最敏感的器官，本实验从股静脉注入血管加压素[3]，引起大鼠冠状动脉等血管的痉挛，造成急性心肌供血不足，加之外周阻力增加，导致心脏负荷加重，直接表现为心电图的缺血改变。这种来自心脏的缺血信息很快传入中枢，在中枢神经系统经过一系列的整合与调节，产生相应的应激反应。这种整合及调节的过程非常复杂，由多级中枢共同参与。
Fos方法自80年代建立以来，已广泛用于显示某一刺激传导的神经通路[4～6]，虽然其结果是通过形态学方法显示，但在某种程度上反映了一定的功能意义，因而被认为是一种形态与功能相结合的指标[3]。在使用Fos法时，我们除严格限制实验条件外，还设立了严格的对照，以保证结果的特异性。对于嗅脑Fos分布在实验组和对照组无明显差异的结果，我们认为与乙醚吸入麻醉有关，嗅皮质对急性心肌缺血似无直接反应。
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Dun[7]在研究心血管反应相关神经元时发现：失血刺激下，Fos阳性产物见于梨状皮质、终纹床核、Calleja核、穹窿下器、杏仁中央核、臂旁核、室旁核、视上核、脑桥A5区、延髓腹外侧部、孤束核、最后区以及脊髓中间带外侧核等；而高血压条件下，则主要密集于终纹床核、杏仁中央核、臂旁核、孤束核和最后区。Vahid-Ansari[8]的研究则表明：急性心肌梗死引起的充血性心力衰竭在发生2～4周后Fos相关基因样(Fra-LI)物质主要见于室旁核、视上核、孤束核、迷走神经背核、最后区，腹外侧的腹外侧网状核以及位于两者之间的中间带等核团。我们在血管加压素诱发急性心肌缺血状态下得到的实验结果基本上包括了以上核团，此外还证实了斜角带核、蓝斑、延髓中间网状等也参与心血管反应。
根据以往的研究[9]推测，上述核团的反应不是彼此孤立，而是构成以延髓内脏带为中心的神经网络。来自内脏的刺激信息经迷走神经或交感神经的传入纤维直接或间接(经脊髓)传至延髓内脏带，延髓内脏带的相关神经元发出纤维直接[10，11]或间接[12](经臂旁核、中脑中央灰质换元)投射至前脑边缘系(梨状皮质、终纹床核、杏仁中央核等)和下丘脑[13](室旁核、视上核等)。前脑边缘系和下丘脑也发出纤维直接或间接(经臂旁核、中脑中央灰质换元)投射至延髓内脏带，延髓内脏带也有纤维投射至脊髓中间带外侧核(交感神经节前神经元)或发出副交感节前纤维支配心脏。由此可见，当急性心肌缺血时，机体的应激反应是受到一个复杂的中枢神经网络的调节。
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本文图3～14见插图第3，4页
图3 终纹床核内的Fos阳性神经元。BST.终纹床核 LV.侧脑室 ×400
Fig.3 Fos-positive neurons in the bed nucleus of stria terminalis.BST, bed nucleus or stria terminalis LV,lateral ventricle ×400
图4 斜角带核内的Fos阳性神经元。HDB.斜角带核水平部 VDB.斜角带核垂直部 ×160
Fig.4 Fos-positive neurons in the nucleus of diagonal band.HDB,horizontal part of the nucleus of diagonal band VDB,vertical part of the nucleus of diagonal band ×160
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图5 杏仁核簇内的Fos阳性神经元。OPT.视束 CE.杏仁中央核 ×160
Fig.5 Fos-positive neurons in the amygdaloid nuclei.OPT,optic tract CE,central amygdaloid nuclei ×160
图6 穹窿下器内的Fos阳性神经元。SFO.穹窿下器 ×160
Fig.6 Fos-positive neurons in the subfornical organ. SFO,subfornical organ ×160
图7 下丘脑室旁核的Fos阳性神经元。3V.第三脑室 PA.下丘脑室旁核 ×400
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Fig.7 Fos-positive neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus.3V,3th ventrical PA,hypothalamic paraventricular nucleus ×400
图8 视上核内的Fos阳性神经元。OPT.视束 SO.视上核 ×160
Fig.8 Fos-positive neurons in the supraoptic nucleus.OPT,optic tract SO,supraoptic nucleus ×160
图9 视交叉上核的Fos阳性神经元。3V.第三脑室 SCH.视交叉上核 ×400
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Fig.9 Fos-positive neurons in the suprachiasmatic nucleus.3V,3th ventrical SCH,suprachiasmatic nucleus ×400
图10 弓状核的Fos阳性神经元。ARC.弓状核 ×160
Fig.10 Fos-positive neurons in the arcuate nucleus.3V,3th ventrical ARC,arcuate nucleus ×160
图11 外侧缰核的Fos阳性神经元。3V.第三脑室 LHB.外侧缰核 ×160
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Fig.11 Fos-positive neurons in the lateral habenular nucleus.3V,3th ventrical LHB,lateral habenular nucleus ×160
图12 中脑中央灰质腹外侧区的Fos阳性神经元。AQ.中脑导水管 CGL.中脑中央灰质外侧区 ×160
Fig.12 Fos-positive neurons in the ventrolateral part of central gray.AQ,mesencephalic aqueduct CGL,lateral part of central gray ×160
, 百拇医药 图13 臂旁外侧核及蓝斑内的Fos阳性神经元。LC.蓝斑 LPB.臂旁外侧核 ×160
Fig.13 Fos-positive neurons in the lateral parabrachial nucleus and locus ceruleus.LC,locus ceruleus LHB,lateral parabrachial nucleus ×160
图14 延髓内脏带中的Fos阳性神经元。AP.最后区 NTS.孤束核 VLRT.腹外侧网状核 ×80
Fig.14 Fos-positive neurons in the medullary visceral zone.AP,area postrema. NTS,nucleus of solitary tract VLRT,ventrolateral reticular nucleus ×80
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【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39770251)
【作者简介】 葛煦(1973—)，男(汉族)，四川成都人，硕士
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【收稿日期】 1999-04-23
【修回日期】 1999-12-14, http://www.100md.com