镉对大鼠睾丸间质细胞脂质过氧化的影响
作者：杨建明 吴向东 金泰廙 蒋学之 丁训诚 吴晓芸
单位：200032 上海医科大学劳动卫生教研室(杨建明、吴向东、金泰廙、蒋学之)；上海市计划生育科学研究所(丁训诚、吴晓芸)
关键词：镉；睾丸；间质细胞；脂质过氧化；细胞存活率
中华劳动卫生职业病杂志/980111Effects of Cadmium on Lipid Peroxidation of Leydig Cells of Rat Testis in Vitro
Yang Jianming,Wu Xiangdong,Jin Taiyi,et al
摘要 目的 观察镉对离体睾丸间质细胞的毒性作用。方法 测定不同CdCl2染毒浓度下(含镉0、10、20和40 μmol/L)间质细胞的脂质过氧化水平。结果 染毒24小时后，染毒组的细胞存活率显著低于对照组(P〈0.01)，且存在剂量-效应关系；随染毒浓度的增高，丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力显著增高(P〈0.05)，而超氧化物歧化酶(SOD)活力则显著下降(P〈0.01)。相关分析结果显示:SOD与MDA呈负相关、与GSH-Px呈显著负相关(r=-0.433 9,P〈0.05);MDA与GSH-Px呈显著正相关(r=0.432 9,P〈0.05)，表明镉可使睾丸间质细胞的脂质过氧化作用增强、抗氧化能力减弱。结论 镉对睾丸间质细胞具有直接毒性作用。
, http://www.100md.com
Effects of cadmium on lipid peroxidation of Leydig cells of rat testis in vitro Yang Jianming*,Wu Xiangdong,Jin Taiyi,et al.* Department of Occupational Health,Shanghai Medical University, Shanghai 200032
Abstract In order to study the toxic effects of cadmium on Leydig cells of rat testis,lipid peroxidation levels of Leydig cells exposed to different concentration of cadmium(i.e.0,10,20 and 40 μmol Cd/L) in vitro were determined.The results showed that twenty-four hours after exposed to cadmium,the cells＇survival rate in the exposed groups was significantly lower than that in the control group(P〈0.01).It was found that there were dose effect relationships between the
, 百拇医药
cell survival rate and cadmium exposure.With increased cadmium exposure dose,the contents of MDA and GSH-Px activity in the exposed groups were significantly higher than those in the control
(P〈0.05),but SOD activity was inverse(P〈0.01).Correlation analysis showed that there were negative correlation between SOD and MDA or GSH-Px(r=-0.433 9,P?.05),and positive correlation between MDA and GSH-Px(r=0.432 9,P〈0.05).It is indicated that Cd could increase lipid peroxidation level and reduce antioxidation ability of Leydig cells from testis in rat,suggesting that cadmium may have direct toxic on them.
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Key words Cadmium Testis Leydig cell Lipid peroxidation Cell survival rate
镉可作用于机体多种器官[1]。 睾丸是其毒作用的最敏感器官之一，急性毒作用可引起睾丸出血、水肿和坏死，慢性毒作用可致生殖能力下降、异常精子率增高以及致癌作用[2~4]。 镉染毒动物睾酮分泌能力的下降，可能与镉的血管毒性有关[5]，也可能是镉对间质细胞的直接毒作用所致。为了解镉对离体睾丸间质细胞的直接毒性作用，我们应用间质细胞离体培养技术，研究了镉对其脂质过氧化作用的影响。
材料与方法
一、动物
成年、健康雄性SD大鼠4只，体重200 g左右，由上海医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
二、方法
1.间质细胞的离体培养：按照Biegel等[6]报道的方法，应用非连续Percoll梯度液分离间质细胞，用RPMI培养液调整细胞浓度至2×105/ml，种于24孔培养板,每孔加0.5 ml。细胞贴壁1～2小时后，更换培养液并染毒。
2.CdCl2染毒：低、中、高浓度组的镉终浓度分别为10、20、40 μmol/L，染毒24小时后，每孔取培养液200 μl,用于脂质过氧化指标的测定。
3.细胞存活率和脂质过氧化指标的测定：细胞存活率测定采用台盼蓝法；黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力;硫代巴比妥酸法(TBA)测定丙二醛(MDA)含量;二硫双硝基苯甲酸(DTNB)法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。
试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
, http://www.100md.com
4.统计分析：用Foxpro软件建立数据库，SPSS for Windows软件进行F检验、t检验和相关分析。
结 果
1.细胞存活率:表1可见，随着染毒剂量的增高，间质细胞的存活率明显降低。经方差分析，差异有显著意义，且有剂量-效应关系，表明镉对睾丸间质细胞有直接毒性作用。
表1 镉对大鼠睾丸间质细胞存活率的影响(
±s)
Table 1 Effect of Cd on cell survival rate of Leydig cells from rat testis(±s) 组 别
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Group
动物数
n
存活率(%)
Cell survival rate
染镉组 Cd-exposed
低剂量
Low dose
6
78.09±1.06
中剂量
Middle dose
, 百拇医药
6
52.68±3.79
高剂量
High dose
6
32.59±2.84
对 照
Control
6
96.51±2.26
F值
F value
662.43
, 百拇医药
2.各组MDA含量、SOD和GSH-Px活力: 表2可见，随着染镉浓度的增加,MDA含量和GSH-Px活力增高,高浓度组的MDA含量显著高于对照组；所有染镉组GSH-Px活力均显著高于对照组;而SOD活力均显著低于对照组。相关分析结果表明:SOD与MDA呈负相关、与GSH-Px呈显著负相关(r=-0.433 9,P〈0.05)；MDA与GSH-Px呈显著正相关(r=0.432 9,P〈0.05)。表明随着染镉剂量的增加，睾丸间质细胞的脂质过氧化作用增强，而其抗氧化能力减弱。
表2 染镉后大鼠睾丸间质细胞MDA含量、SOD和GSH-Px活力(±s,n=6)
Table 2 Contents of MDA，SOD and GSH-Px activities of Leydig cells of rats after Cd-exposure(±s,n=6) 组 别
, 百拇医药
Group
MDA
(μmol/ml)
SOD
(NU/ml)
GSH-Px
(μmol/min)
染镉组 Cd-exposed
低剂量
Low dose
1.32±0.85
398.10±8.40**
, 百拇医药
27.31±3.06*
中剂量
Middle dose
1.38±0.53
386.99±27.77**
28.53±1.82**
高剂量
High dose
1.98±0.99*
377.45±22.35**
, http://www.100md.com
30.23±1.11**
对 照
Control
0.94±0.27
435.58±25.35
23.87±1.99
与对照组比较，*P〈0.05，**P〈0.01;NU/ml：亚硝酸盐单位
*P〈0.05,**P〈0.01 vs control;NU/ml is the unit of nitrite
讨 论
, 百拇医药
睾丸是镉的靶器官之一，其毒作用机制还不清楚。有报道，镉引起大鼠肝细胞膜通透性的增加与其诱导的活性氧有关[7]。 镉可影响整体动物和离体睾丸细胞睾酮的分泌[8]，而睾酮主要是由间质细胞合成和分泌，它是控制精子生成的重要因素。
镉是一种强的脂质过氧化诱导剂，具有较强的遗传毒性。动物染镉后造成的脂质过氧化损伤可通过直接或间接作用引起染色体畸变数增加，提示镉的脂质过氧化损伤与其遗传毒性可能存在某种内在联系[9]。王俊改等[10]给小鼠腹腔注射镉0.23 mg/kg体重，没发现睾丸组织脂质过氧化反应增强。本研究离体间质细胞培养的结果显示:随染毒浓度的增加，培养液中的MDA含量显著增高;GSH-Px活力增大;而SOD活力显著降低。表明染毒组间质细胞的脂质过氧化作用增强，自由基产生增多。GSH-Px活力的增强是间质细胞对镉引发过氧化作用应激反应的表现。染毒组离体研究培养液中
, 百拇医药 的SOD活力显著下降，表明其抗氧化能力在减弱，从而降低了其清除氧自由基的能力。本研究结果提示：镉对间质细胞有直接毒性作用，其脂质过氧化作用的增强以及抗氧化能力的减弱，在一定程度上解释了镉的间质细胞毒性。
参 考 文 献
1 Waalkes MP,Coogan TP,Barter RA.Toxicological principles of metal carcinogenesis with special emphasis on cadmium.Crit Rev Toxicol,1992,22:175～201.
2 Waalkes MP,Rehm S.Carcinogenicity of oral cadmium in the male Wistar(WF/NCr) rat: effects of chronic dietary zinc deficiency.Fundam Appl Toxicol,1992,19:512～520.
, 百拇医药
3 Guan SA,Gould TC.Cadmium and other elements.In:Johnson AD,Gomes WR,VanDemark NL eds.The Testes: Influencing Factors.Vol 3.New York: Academic Press,1970.377～481.
4 Saygi S,Denis G,Kutsal O,et al.Chronic effects of cadmium on kidney,liver,testis,and fertility of male rats.Biol Trace Elem Res,1991,31:209～214.5 Bonde JP,Giweroman A.Occupational hazards to male fecundity. Reproductive Medicine Review,1995,4:59～73.
6 Biegel LB,Cook JC,Hurtt ME.Isolation and primary culture of Leydig cells.In: Robert E,Chapin RE,Heindel JJ Eds.Methods in Toxicology,Part A.Male Reproductive Toxicology.Vol 3.San Diego:Academic Press,1993.182～196.
, 百拇医药
7 Koizumi T,Shirakura H,Kumagai H,et al.Mechanism of cadmium-induced cytotoxicity in rat hepotocytes: cadmium-induced active oxygen-related permeability changes of the plasma membrane.Toxicol,1996,114:125～134.
8 王丙云.镉和锌对在体和离体睾丸细胞分泌睾酮的影响.环境与健康杂志,1993,10:30.
9 常薇,陈学敏,杨成峰.镉的遗传毒性与脂质过氧化的关系及硒锗的拮抗作用研究.
中国公共卫生学报,1996,15:335.
10王俊改,马军,吴南屏.硒与镉对小鼠肝、肾、睾丸组织脂质过氧化的交互影响.
中国公共卫生学报,1997,16:37～38.2](收稿：1997-06-23 修回：1997-12-09), 百拇医药
单位：200032 上海医科大学劳动卫生教研室(杨建明、吴向东、金泰廙、蒋学之)；上海市计划生育科学研究所(丁训诚、吴晓芸)
关键词：镉；睾丸；间质细胞；脂质过氧化；细胞存活率
中华劳动卫生职业病杂志/980111Effects of Cadmium on Lipid Peroxidation of Leydig Cells of Rat Testis in Vitro
Yang Jianming,Wu Xiangdong,Jin Taiyi,et al
摘要 目的 观察镉对离体睾丸间质细胞的毒性作用。方法 测定不同CdCl2染毒浓度下(含镉0、10、20和40 μmol/L)间质细胞的脂质过氧化水平。结果 染毒24小时后，染毒组的细胞存活率显著低于对照组(P〈0.01)，且存在剂量-效应关系；随染毒浓度的增高，丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力显著增高(P〈0.05)，而超氧化物歧化酶(SOD)活力则显著下降(P〈0.01)。相关分析结果显示:SOD与MDA呈负相关、与GSH-Px呈显著负相关(r=-0.433 9,P〈0.05);MDA与GSH-Px呈显著正相关(r=0.432 9,P〈0.05)，表明镉可使睾丸间质细胞的脂质过氧化作用增强、抗氧化能力减弱。结论 镉对睾丸间质细胞具有直接毒性作用。
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Effects of cadmium on lipid peroxidation of Leydig cells of rat testis in vitro Yang Jianming*,Wu Xiangdong,Jin Taiyi,et al.* Department of Occupational Health,Shanghai Medical University, Shanghai 200032
Abstract In order to study the toxic effects of cadmium on Leydig cells of rat testis,lipid peroxidation levels of Leydig cells exposed to different concentration of cadmium(i.e.0,10,20 and 40 μmol Cd/L) in vitro were determined.The results showed that twenty-four hours after exposed to cadmium,the cells＇survival rate in the exposed groups was significantly lower than that in the control group(P〈0.01).It was found that there were dose effect relationships between the
, 百拇医药
cell survival rate and cadmium exposure.With increased cadmium exposure dose,the contents of MDA and GSH-Px activity in the exposed groups were significantly higher than those in the control
(P〈0.05),but SOD activity was inverse(P〈0.01).Correlation analysis showed that there were negative correlation between SOD and MDA or GSH-Px(r=-0.433 9,P?.05),and positive correlation between MDA and GSH-Px(r=0.432 9,P〈0.05).It is indicated that Cd could increase lipid peroxidation level and reduce antioxidation ability of Leydig cells from testis in rat,suggesting that cadmium may have direct toxic on them.
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Key words Cadmium Testis Leydig cell Lipid peroxidation Cell survival rate
镉可作用于机体多种器官[1]。 睾丸是其毒作用的最敏感器官之一，急性毒作用可引起睾丸出血、水肿和坏死，慢性毒作用可致生殖能力下降、异常精子率增高以及致癌作用[2~4]。 镉染毒动物睾酮分泌能力的下降，可能与镉的血管毒性有关[5]，也可能是镉对间质细胞的直接毒作用所致。为了解镉对离体睾丸间质细胞的直接毒性作用，我们应用间质细胞离体培养技术，研究了镉对其脂质过氧化作用的影响。
材料与方法
一、动物
成年、健康雄性SD大鼠4只，体重200 g左右，由上海医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
二、方法
1.间质细胞的离体培养：按照Biegel等[6]报道的方法，应用非连续Percoll梯度液分离间质细胞，用RPMI培养液调整细胞浓度至2×105/ml，种于24孔培养板,每孔加0.5 ml。细胞贴壁1～2小时后，更换培养液并染毒。
2.CdCl2染毒：低、中、高浓度组的镉终浓度分别为10、20、40 μmol/L，染毒24小时后，每孔取培养液200 μl,用于脂质过氧化指标的测定。
3.细胞存活率和脂质过氧化指标的测定：细胞存活率测定采用台盼蓝法；黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力;硫代巴比妥酸法(TBA)测定丙二醛(MDA)含量;二硫双硝基苯甲酸(DTNB)法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。
试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
, http://www.100md.com
4.统计分析：用Foxpro软件建立数据库，SPSS for Windows软件进行F检验、t检验和相关分析。
结 果
1.细胞存活率:表1可见，随着染毒剂量的增高，间质细胞的存活率明显降低。经方差分析，差异有显著意义，且有剂量-效应关系，表明镉对睾丸间质细胞有直接毒性作用。
表1 镉对大鼠睾丸间质细胞存活率的影响(
±s)Table 1 Effect of Cd on cell survival rate of Leydig cells from rat testis(
±s) 组 别, http://www.100md.com
Group
动物数
n
存活率(%)
Cell survival rate
染镉组 Cd-exposed
低剂量
Low dose
6
78.09±1.06
中剂量
Middle dose
, 百拇医药
6
52.68±3.79
高剂量
High dose
6
32.59±2.84
对 照
Control
6
96.51±2.26
F值
F value
662.43
, 百拇医药
2.各组MDA含量、SOD和GSH-Px活力: 表2可见，随着染镉浓度的增加,MDA含量和GSH-Px活力增高,高浓度组的MDA含量显著高于对照组；所有染镉组GSH-Px活力均显著高于对照组;而SOD活力均显著低于对照组。相关分析结果表明:SOD与MDA呈负相关、与GSH-Px呈显著负相关(r=-0.433 9,P〈0.05)；MDA与GSH-Px呈显著正相关(r=0.432 9,P〈0.05)。表明随着染镉剂量的增加，睾丸间质细胞的脂质过氧化作用增强，而其抗氧化能力减弱。
表2 染镉后大鼠睾丸间质细胞MDA含量、SOD和GSH-Px活力(
±s,n=6)Table 2 Contents of MDA，SOD and GSH-Px activities of Leydig cells of rats after Cd-exposure(
±s,n=6) 组 别, 百拇医药
Group
MDA
(μmol/ml)
SOD
(NU/ml)
GSH-Px
(μmol/min)
染镉组 Cd-exposed
低剂量
Low dose
1.32±0.85
398.10±8.40**
, 百拇医药
27.31±3.06*
中剂量
Middle dose
1.38±0.53
386.99±27.77**
28.53±1.82**
高剂量
High dose
1.98±0.99*
377.45±22.35**
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30.23±1.11**
对 照
Control
0.94±0.27
435.58±25.35
23.87±1.99
与对照组比较，*P〈0.05，**P〈0.01;NU/ml：亚硝酸盐单位
*P〈0.05,**P〈0.01 vs control;NU/ml is the unit of nitrite
讨 论
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睾丸是镉的靶器官之一，其毒作用机制还不清楚。有报道，镉引起大鼠肝细胞膜通透性的增加与其诱导的活性氧有关[7]。 镉可影响整体动物和离体睾丸细胞睾酮的分泌[8]，而睾酮主要是由间质细胞合成和分泌，它是控制精子生成的重要因素。
镉是一种强的脂质过氧化诱导剂，具有较强的遗传毒性。动物染镉后造成的脂质过氧化损伤可通过直接或间接作用引起染色体畸变数增加，提示镉的脂质过氧化损伤与其遗传毒性可能存在某种内在联系[9]。王俊改等[10]给小鼠腹腔注射镉0.23 mg/kg体重，没发现睾丸组织脂质过氧化反应增强。本研究离体间质细胞培养的结果显示:随染毒浓度的增加，培养液中的MDA含量显著增高;GSH-Px活力增大;而SOD活力显著降低。表明染毒组间质细胞的脂质过氧化作用增强，自由基产生增多。GSH-Px活力的增强是间质细胞对镉引发过氧化作用应激反应的表现。染毒组离体研究培养液中
, 百拇医药 的SOD活力显著下降，表明其抗氧化能力在减弱，从而降低了其清除氧自由基的能力。本研究结果提示：镉对间质细胞有直接毒性作用，其脂质过氧化作用的增强以及抗氧化能力的减弱，在一定程度上解释了镉的间质细胞毒性。
参 考 文 献
1 Waalkes MP,Coogan TP,Barter RA.Toxicological principles of metal carcinogenesis with special emphasis on cadmium.Crit Rev Toxicol,1992,22:175～201.
2 Waalkes MP,Rehm S.Carcinogenicity of oral cadmium in the male Wistar(WF/NCr) rat: effects of chronic dietary zinc deficiency.Fundam Appl Toxicol,1992,19:512～520.
, 百拇医药
3 Guan SA,Gould TC.Cadmium and other elements.In:Johnson AD,Gomes WR,VanDemark NL eds.The Testes: Influencing Factors.Vol 3.New York: Academic Press,1970.377～481.
4 Saygi S,Denis G,Kutsal O,et al.Chronic effects of cadmium on kidney,liver,testis,and fertility of male rats.Biol Trace Elem Res,1991,31:209～214.5 Bonde JP,Giweroman A.Occupational hazards to male fecundity. Reproductive Medicine Review,1995,4:59～73.
6 Biegel LB,Cook JC,Hurtt ME.Isolation and primary culture of Leydig cells.In: Robert E,Chapin RE,Heindel JJ Eds.Methods in Toxicology,Part A.Male Reproductive Toxicology.Vol 3.San Diego:Academic Press,1993.182～196.
, 百拇医药
7 Koizumi T,Shirakura H,Kumagai H,et al.Mechanism of cadmium-induced cytotoxicity in rat hepotocytes: cadmium-induced active oxygen-related permeability changes of the plasma membrane.Toxicol,1996,114:125～134.
8 王丙云.镉和锌对在体和离体睾丸细胞分泌睾酮的影响.环境与健康杂志,1993,10:30.
9 常薇,陈学敏,杨成峰.镉的遗传毒性与脂质过氧化的关系及硒锗的拮抗作用研究.
中国公共卫生学报,1996,15:335.
10王俊改,马军,吴南屏.硒与镉对小鼠肝、肾、睾丸组织脂质过氧化的交互影响.
中国公共卫生学报,1997,16:37～38.2](收稿：1997-06-23 修回：1997-12-09), 百拇医药