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编号:10287602
超氧阴离子自由基对大鼠肝卵圆细胞胞内自由钙浓度的影响
http://www.100md.com 《基础医学与临床》 2000年第4期
     作者:廖钢陵 李芸 俞志宏 刘旭 吴元德

    单位:廖钢陵(中国医学科学院基础医学研究所,中国协和医科大学基础医学院,北京100005);李芸(中国医学科学院基础医学研究所,中国协和医科大学基础医学院,北京100005);俞志宏(中国医学科学院基础医学研究所,中国协和医科大学基础医学院,北京100005);刘旭(中国医学科学院基础医学研究所,中国协和医科大学基础医学院,北京100005)

    关键词:超氧阴离子自由基;肝卵圆细胞;钙;激光共聚焦扫描显微镜

    基础医学与临床000423 摘要:采用激光共聚焦扫描显微镜,观察黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应系统(X/XO)生成不同浓度的超氧阴离子自由基()致培养的大鼠肝卵圆细胞(WB细胞)胞质内钙浓度的变化,结果发现:仅小剂量的(X:200mmol/L XO: 0.2mu/mL)引起胞质内钙浓度升高,约30s后达到峰值,60s后恢复正常。部分细胞观察到数次钙浓度间断升高、幅度逐渐下降的现象。超氧化物歧化酶(SOD)可抑制此变化,过氧化氢酶(CAT)无效果。细胞在无钙液中观察仍出现钙峰,但受内钙库耗竭剂Thapsigargin阻断。结果表明,小剂量可诱使肝卵圆细胞胞内钙库钙释放造成瞬间胞质自由钙浓度增高,并可能引发胞内钙浓度的衰减振荡,此可能与通过影响胞内重要信号转导因子钙,调控细胞生物学功能如增殖、转化相关。
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    中图分类号:R322.4+7 文献标识码:A

    文章编号:1001-6352(2000)04-0074-04

    Effect of superoxide anions on intracellular free calcium concentration in rat liver oval cells

    LIAO Gang-ling LI Yun YU Zhi-hong WU Yuan-de et al

    (Institute of Basic Medical Sciences,CAMS&School of Basic Medicine,PUMC,Beijing 100005,China)

    Abstract:The effects of superoxide anion () of various concentrations generated by interaction of xanthine with xanthine oxidase (X/XO) on dynamic changes of intracellular free calcium concentration([Ca2+]i) in cultural rat liver oval cells (WB cells) were investigated by fluorescence of Fluo-3 combined with Ca2+ on laser scanning conforcal microscopy.The results showed that a rapid [Ca2+]i increase occured after treatment with of low concentration (X: 200mmol/L,XO: 0.2mu/mL) immediately,top of the [Ca2+]i appeared at thirty seconds after treatment and returned to normal at sixty seconds.In some of the cells,a decaying [Ca2+]i oscillating could be ovserved,but no any changes of the [Ca2+]i appeared in the cells which were treated by  of middle and high concentration (X: 200mmol/L,XO: 5mu/mL and X: 500mmol/L,XO: 20mu/mL).The changes of [Ca2+]i were inhibited by superoxide dismutase (SOD),but catalase (CAT) not.The cells experimented in the medium of D-Hank's with EGTA were observed the change of [Ca2+]i also,but the changes were blocked in the normal medium with thapsigangin,which depleted [Ca2+]i stores.The results suggest that the changes of [Ca2+]i induced by of low concentration might due to the role of intracellular Ca2+ pools release and they might be related to action of cellular signal transduction induced by which could stimulate proliferation or transformation of the cell.
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    Key words:superoxide anion; WB cell; Ca2+ ; laser scanning conforcal microscopy

    肝癌在人类恶性肿瘤发生中占有重要地位,许多化学因素与肝癌的发生密切相关,研究表明,自由基、活性氧在化学致、促癌过程中起重要作用,也可能参与了化学因子引发肝癌的发生过程[1]。我们曾在2-乙酰胺基芴(2-AFF)引发大鼠肝癌发生过程中证明了癌前病灶来自肝卵圆细胞,确定其为肝癌前体细胞的作用[2]。并以此细胞为模型,进一步证实了低剂量的(X:200mmol/L XO: 0.2mu/mL)可促使培养的肝卵圆细胞株(WB细胞)显著增生及在一定条件下发生转化;而在中剂量的(X: 200mmol/L XO: 5mu/mL)及高剂量的(X: 200mmol/L XO: 20mu/mL)作用下细胞相应地发生凋亡及坏死。进而发现在低剂量的作用下,WB细胞的膜蛋白及膜脂理化特性及与增殖、转化相关的癌基因c-fos、c-jun也出现一定的变化及表达。本文研究对WB细胞胞质内钙浓度的影响及来源,以期了解胞内重要信息转导因子Ca2+在 诱发细胞增殖、转化中的作用及机理。
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    1 材料与方法

    1.1 试剂与仪器

    黄嘌呤(X)、超氧化物歧化酶(SOD)、胰岛素、庆大霉素、Fluo-3/AM、乙二醇-双-(2-氨乙基)四乙酸(EGTA)、Thapsigargin(TG)为Sigma公司产品;黄嘌呤氧化酶(XO)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(Hepes)为Bocheringer Mannkein公司产品;二甲基亚砜(DMSO)为Merck公司产品;RPMI 1640培养基、胰酶为Gibcobrl公司产品;超级胎牛血清(FCS)购自杭州四季青生物工程材料所,其余试剂均为国产分析纯。CO2培养箱:日本HIRASAWA型;生物化学发光测定仪:上海市技术监督局实验工厂生产,SHG-1型;激光共聚焦扫描显微镜:美国MERIDIAN,vltima212型。

    1.2 细胞培养

    WB-F344细胞(WB细胞)为美国北卡罗来那大学Grisham教授实验室建立,由中国医学科学院药物研究所韩锐教授实验室提供。细胞生长在复合RPMI 1640培养液中,含10% FCS,胰岛素4mg/L,Hepes 20mmol/L,庆大霉素 50mg/L中,于37℃、5% CO2培养,细胞传代时用0.125%胰酶消化,稀释成5×104个/mL细胞悬液,每100mL培养瓶接种细胞悬液8mL。
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    1.3 的产生及测定

    20mg X加D-Hank's液10mL,滴加少许NaOH促溶;XO以D-Hank's液制成1u/mL母液备用。实验时在各实验系统中均加入X浓度为200mmol/L,XO值按实验要求产生的剂量大小分别加入高剂量(XO: 20mu/mL)、中剂量(XO: 5mu/mL)及低剂量(XO: 0.2mu/mL)。因XO活性易变,以化学发光法检测每次实验产生的均一性。

    1.4 细胞处理及Fluo-3/AM负载

    细胞接种于35mm培养皿中,浓度约为5×104个/皿。培养过夜,细胞散在贴壁生长。检测前以37℃预温Hank's液1mL取代原培养液,加入以DMSO溶解的Fluo-3/AM 3mL(0.1%),放回培养箱保温45min。

    1.5 激光共聚焦扫描显微镜观察
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    每次镜下选取生长良好2~3个细胞处于最佳观察视野,以488nm氩激光激发。用x、y平面扫描,采集数据,进行图象分析,在连续扫描过程中按实验计划加入不同试剂作用,微机给出细胞内荧光强度图象及荧光强度时间变化曲线,实验重复10次。

    2 结果

    加入X 200mmol/L后,细胞出现维持时间约3min的钙浓度增高峰,在其下降末端加入不同剂量的XO,仅在XO为0.2mu/mL时细胞均出现胞内钙浓度再度升高,30s后达锋值,60s后恢复正常(图1)。实验中仅加入XO未发现胞内钙任何变化。约10%的细胞除出现上述钙峰外,还可观察到延续数次钙浓度间断升高幅度逐渐下降的变化(图2)。加入SOD,未抑制X所引起的胞内钙增加,但明显抑制XO引起的钙峰。预先加入CAT对X及XO引起的胞内钙增高均无影响。在含EGTA的D-Hank's无钙外液中,X诱发胞内钙浓度升高现象消失,但并不影响XO的作用(图3)。加入胞内钙库耗竭剂TG,胞内钙升高且持续一定时间,加入X后出现在此基础上的钙浓度进一步升高,但加入XO后所引起的胞内钙升高峰消失(图4)。低于300mmol/L的H2O2也能引起WB细胞胞质内钙增高(图5),表现为一过性Ca2+上升峰和随后的Ca2+持续性增高。此一过性峰在TG存在时仍存在,但在存有EGTA的无外钙溶液中消失。
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    图1 单独加入X(200 μmol/L)以及随后加入XO(0.2mu/mL)引起的WB 细胞内一次性钙浓度升高峰

    Fig 1 Addition of X (200 μmol/L)alone and then followed by

    XO (0.2mu/mL)both caused a transient spike of Ca 2+ in WB

    cells

    图2 X/XO引起的WB细胞胞浆内钙升高及钙振荡

    Fig 2 Treatment of X and XO caused a transient spike and
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    then a decaying oscillation of cytoplasmic Ca2+ in WB cells

    图3 EGTA 使X作用的钙峰消失但不影响随后

    加入XO诱发的钙跃升

    Fig 3 EGTA blocked the increase of Ca2+ caused by X alone

    but did not affect the change of Ca2+ caused by addition of XO
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    图4 TG 使X 存在下加XO 引起的Ca2+峰消失

    但对X 的Ca2+增高作用无影响

    Fig 4 TG inhibited the spike of Ca2+ induced by X/XO,but

    didn't the changes caused by X

    图5 低于300nmol/L的H2O2引起的WB细胞一过性

    Ca2+升高与持续性Ca2+增加
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    Fig 5 A transient spike and continued increase of Ca2+

    induced by H2O2 with concentration lower than 300nmol/L

    3 讨论

    一定剂量的活性氧促进细胞的增殖、转化已越来越受到普遍重视[3]。我们也报道过小剂量的 诱发NIH3T3细胞发生转化,在强致癌物苯并芘的启动下转化率更高,其作用机理可能与影响细胞信号转导系统相关[4]。目前已有研究显示可以作为一种细胞信号转导启动因子或本身就是一种信号分子,对细胞的生长、增殖、转化起一定的调控作用[5,6]。Ca2+在调控多种细胞生物学效应过程中起到重要的第二信使作用,胞内Ca2+浓度增高既可以来源于细胞外环境,也可来自于细胞内钙库[7]。活性氧通过影响胞质内钙浓度的变化从而调节细胞生物学效应已有较多报道,但由于采用活性氧种类不同、剂量差异以及检测方法的局限而结果不尽相同,迄今X/XO所诱发胞质内钙变化的机理仍然不清楚[8]。本文发现:1.低剂量的X/XO能够迅即引发胞质内Ca2+单次跃升或出现Ca2+浓度衰减振荡。由于其变化受到SOD抑制而CAT无影响,提示此乃引发胞质内钙的变化。2.加入X后,也能观察到胞质内Ca2+的增高,但其峰型与前者明显不同,在有EGTA的D-Hank's液中,Ca2+增高完全消失,对随后加入XO引发的Ca2+跃升及振荡无影响,说明X所引起的胞质内Ca2+浓度升高可能来源于外钙流入,而所引发的胞质内Ca2+浓度升高来源于内钙库释放。后者可由实验中加入内钙耗竭剂TG后再加入XO未出现胞质内Ca2+浓度升高而进一步加以证实。3.一定剂量的H2O2也能直接引发胞质内Ca2+增加,但变化峰型与所引发的明显不同,并且实验证明此来源于外钙流入。由于激光共聚焦扫描显微镜可以对胞质内钙浓度变化进行动态观察,因此可以分别研究X、XO及影响胞内钙浓度变化的特征及来源,获得较为确切的结果。本实验中发现引发WB细胞发生凋亡及坏死的中、高剂量X/XO未出现细胞内钙浓度的变化,仅在低剂量X/XO生成的作用下,WB细胞胞质内钙浓度出现瞬间的升高或振荡。提示低剂量的可能通过影响WB细胞内钙浓度的变化,促使细胞增殖或转化,其必然关系仍需进一步证明。另外和H2O2诱发WB细胞胞质内钙升高峰型及来源有明显差异,其对细胞的生物学效应的意义也需深入研究。
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    基金项目:国家自然科学基金资助课题(No.39670196)

    作者单位:吴元德(中国医学科学院基础医学研究所,中国协和医科大学基础医学院,北京100005)

    参考文献:

    [1] 吴元德,自由基与肿瘤.陈瑗,周玫主编,自由基医学[M].北京:人民军医出版社,1991,258-296.

    [2] 廖钢陵,陈晋彦,丁濂,等.大鼠肝癌前病灶与卵圆细胞的关系[J].中华病理学杂志,1998,27(4):87-90.

    [3] Burdon,RH.Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation[J].Free Rad Biol&Med,1995,18(4):775-794.
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    [4] 房克忠,俞志宏,邱琦,等.超氧阴离子自由基对NIH3T3细胞的转化作用[J].基础医学与临床,1996,16(2):49-52.

    [5] Suzuki,YJ.Formen HJ,Sevanian A.Oxidants as stimulators of signal transduction[J].Free Rad Biol&Med,1997,22:269-285.

    [6] Lander HM.An essential role for free radicals and derived species in signal transduction[J].The FASEB Journal,1997,11:118-124.

    [7] 方芳,张放,刘景生.胞内倍使-Ca2+.刘景生主编.细胞信息与调控[M].北京:北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社,1998,187-204.

    [8] Dreher D,Jornot L,Junod AF.Effects of hypoxanthine-xanthine oxidase on Ca2+ stores and protein synethesis in human endothelial cells[J].Circulation Research,1995,76(3):388-395.

    收稿日期:1998-11-10

    修回日期:1999-04-27, 百拇医药