补阳还五汤及其精简方(脑健片)对脑缺血大鼠海马组织CDK4/CyclinD1表达的影响(1)
[摘要]评价补阳还五汤及其精简方(脑健片)对脑缺血体内模型大鼠海马组织周期蛋白CDK4/CyclinD1的调控。将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤干预组(灌胃3.15g·kg-1)及补阳精简方干预组(灌胃2.41g·kg-1)，每组按给药后1，3，7，14，28d再各分5组。采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法考察不同时间点各组大鼠海马组织中CDK4/CyclinD1的表达。结果发现脑缺血模型大鼠海马组织中，CDK4/CyclinD1的表达上调，与假手术组比P<0.01，提示脑缺血损伤将激活细胞周期信号通路；补阳还五汤及其精简方干预后的3，7，14，28d均能显著降低周期蛋白的表达，与模型组比P<0.05，提示补阳还五汤及其精简方均可通过细胞周期信号通路对神经细胞发挥保护作用。
[关键词]补阳还五汤；补阳还五精简方(脑健片)；脑缺血；CDK4/CyclinD1
补阳还五汤出自《医林改错瘫萎论》，系清代医家王清任创立的治疗半身不遂辩证属气虚血瘀证的经典名方[1]。由于补阳还五汤作为传统中药方剂，药效物质基础难以阐明，且携带、服用不便，不能完全满足国际市场的标准规范，因此针对病因病机筛选出物质基础明确、给药剂量小、疗效好的中成药是当今中医药治疗脑缺血的发展方向[23]。本课题组遵循补阳还五汤之方义，基于益气祛瘀生新法，将补阳还五汤精简为黄芪、川芎和地龙，三药合用，意即通过活血、祛瘀或化旧等方法来获得“生新”，从而达到瘀去新生病愈体复的治疗目的。同时，为更好发挥中药复方的整体功效，减少传统汤剂在煎煮过程中一些有效成分的丢失，本课题组将超临界二氧化碳萃取法和醇提、水煎工艺相结合，对补阳精简方选中的3味药材进行提取加工制备成新制剂，命名为脑健片，以保证中药有效成分最大限度溶出。
本课题组采用体外氧化应激细胞模型和体内局灶性脑缺血模型(MCAO)证实了补阳精简方(脑健片)对脑缺血损伤疗效显著[45]，并一定程度阐述了补阳还五汤调控脑缺血的作用机制[67]。
脑缺血对脑神经元损伤的机制非常复杂，其中细胞周期相关蛋白发挥了重要作用。研究发现在MCAO模型中，许多细胞周期相关蛋白表达增加，特别是脑缺血灶周边区神经元内CDK4/CyclinD1的表达是评估缺血神经元是否再次进入细胞周期的关键标志物[8]。基于此，本文拟研究补阳还五汤及其精简方(脑健片)是否能通过细胞周期信号通路对神经元发挥保护作用，并比较2方对CDK4/CyclinD1的调控程度，从分子层面为补阳还五精简方(脑健片)的有效性和合理性提供有力的科学依据，为将其发展成为现代中药制剂奠定实验基础。
1材料
补阳还五汤干浸膏(黄芪120g，当归6g，赤芍4.5g，川芎3g，红花3g，桃仁3g，地龙3g)和脑健片(补阳精简方：黄芪30g，川芎9g，地龙6g)均由湖南中医研究院中药研究所张水寒教授提供。补阳还五汤按传统水煎法浓缩干燥后制备成干浸膏，相当于原生药4.5g-1；脑健片按新工艺制备，其中川芎以挥发油量为考查指标，对川芎粗粉进行SFECO2萃取，不加夹带剂，提取1.5h；地龙以醇浸膏得率及氮含量为指标，温浸2次，第1次加5倍量50%乙醇温浸48h，第2次加4倍量50%乙醇温浸48h；再合并药渣，与黄芪药粉一同水煎，所有药液浓缩干燥后即得干浸膏，相当于原生药4.7g-1。
SPF级SD大鼠，体重250～280g，雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号SCXK(京)20120001。
兔抗大鼠CDK4多克隆抗体(批号20130311)，兔抗大鼠CyclinD1多克隆抗体(批号20130508)(武汉博士德生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(批号20121011)，PV6001(批号20120903)(北京中衫金桥生物技术有限公司)；超纯RNA提取试剂盒(批号CW0597)，UltraSYBRMixture(WithhighROX)(批号CW2329A)，RNaseⅠ(批号CW2090A)(北京康为世纪生物科技有限公司)；FirstStrandcDNASynthesisKit(批号K1622，Fermentas公司)；RIPA组织细胞快速裂解液(批号BYL4082，上海基尔顿生物)；GAPDH(CST公司)；其他试剂均为分析纯。
ImageProExpress图像分析系统(日本Olympus)；Finesse325石蜡切片机(英国Shando)；Bx51光学显微镜(日本Olympus)；手握式电动匀浆机(德国FLUKO)；3K15低温冷冻离心机(美国Sigma)；7300RealtimePCR检测仪(美国ABI)。
2方法
2.1动物模型的制备及评价参照文献方法采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血大鼠模型[910]。假手术组不插入鱼线，仅切开皮肤、分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉后即缝合。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒内，自由饮水、进食。动物于清醒后2h参照Longa[11]的5分制法进行神经功能评分，分值在1～3分者入组，动物清醒后爬行时向右转圈(追尾现象)，严重时向右跌倒，提尾时右前肢内收屈曲提示造模成功。
2.2分组及给药将SD大鼠分为假手术组和MCAO手术组。MCAO手术组大鼠根据术后神经功能评分情况分层随机分为模型组(不给药)、补阳还五汤给药组、脑健片给药组，每组各50只(分1，3，7，14，28d5个时间点，每个时间点10只，其中5只用于免疫组化、5只用于RTPCR)。均于手术后第1天开始给药，每日1次，模型组和假手术组动物均灌胃等体积无菌蒸馏水，自由饮食、活动。药物干预组给药剂量根据前期剂量筛选实验[3]，将补阳还五汤及其精简方设高、中、低剂量组，考察不同剂量药物对MCAO大鼠脑水肿、梗死面积及体质量的影响，结果显示补阳还五汤组以干浸膏3.15g·kg-1灌胃和补阳精简方组以干浸膏2.41g·kg-1灌胃疗效最佳，与模型组比有统计学差异(P<0.05)。 (刘芳 王宇红 蔡光先 佘颜 邵乐 夏相宜)
[关键词]补阳还五汤；补阳还五精简方(脑健片)；脑缺血；CDK4/CyclinD1
补阳还五汤出自《医林改错瘫萎论》，系清代医家王清任创立的治疗半身不遂辩证属气虚血瘀证的经典名方[1]。由于补阳还五汤作为传统中药方剂，药效物质基础难以阐明，且携带、服用不便，不能完全满足国际市场的标准规范，因此针对病因病机筛选出物质基础明确、给药剂量小、疗效好的中成药是当今中医药治疗脑缺血的发展方向[23]。本课题组遵循补阳还五汤之方义，基于益气祛瘀生新法，将补阳还五汤精简为黄芪、川芎和地龙，三药合用，意即通过活血、祛瘀或化旧等方法来获得“生新”，从而达到瘀去新生病愈体复的治疗目的。同时，为更好发挥中药复方的整体功效，减少传统汤剂在煎煮过程中一些有效成分的丢失，本课题组将超临界二氧化碳萃取法和醇提、水煎工艺相结合，对补阳精简方选中的3味药材进行提取加工制备成新制剂，命名为脑健片，以保证中药有效成分最大限度溶出。
本课题组采用体外氧化应激细胞模型和体内局灶性脑缺血模型(MCAO)证实了补阳精简方(脑健片)对脑缺血损伤疗效显著[45]，并一定程度阐述了补阳还五汤调控脑缺血的作用机制[67]。
脑缺血对脑神经元损伤的机制非常复杂，其中细胞周期相关蛋白发挥了重要作用。研究发现在MCAO模型中，许多细胞周期相关蛋白表达增加，特别是脑缺血灶周边区神经元内CDK4/CyclinD1的表达是评估缺血神经元是否再次进入细胞周期的关键标志物[8]。基于此，本文拟研究补阳还五汤及其精简方(脑健片)是否能通过细胞周期信号通路对神经元发挥保护作用，并比较2方对CDK4/CyclinD1的调控程度，从分子层面为补阳还五精简方(脑健片)的有效性和合理性提供有力的科学依据，为将其发展成为现代中药制剂奠定实验基础。
1材料
补阳还五汤干浸膏(黄芪120g，当归6g，赤芍4.5g，川芎3g，红花3g，桃仁3g，地龙3g)和脑健片(补阳精简方：黄芪30g，川芎9g，地龙6g)均由湖南中医研究院中药研究所张水寒教授提供。补阳还五汤按传统水煎法浓缩干燥后制备成干浸膏，相当于原生药4.5g-1；脑健片按新工艺制备，其中川芎以挥发油量为考查指标，对川芎粗粉进行SFECO2萃取，不加夹带剂，提取1.5h；地龙以醇浸膏得率及氮含量为指标，温浸2次，第1次加5倍量50%乙醇温浸48h，第2次加4倍量50%乙醇温浸48h；再合并药渣，与黄芪药粉一同水煎，所有药液浓缩干燥后即得干浸膏，相当于原生药4.7g-1。
SPF级SD大鼠，体重250～280g，雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号SCXK(京)20120001。
兔抗大鼠CDK4多克隆抗体(批号20130311)，兔抗大鼠CyclinD1多克隆抗体(批号20130508)(武汉博士德生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(批号20121011)，PV6001(批号20120903)(北京中衫金桥生物技术有限公司)；超纯RNA提取试剂盒(批号CW0597)，UltraSYBRMixture(WithhighROX)(批号CW2329A)，RNaseⅠ(批号CW2090A)(北京康为世纪生物科技有限公司)；FirstStrandcDNASynthesisKit(批号K1622，Fermentas公司)；RIPA组织细胞快速裂解液(批号BYL4082，上海基尔顿生物)；GAPDH(CST公司)；其他试剂均为分析纯。
ImageProExpress图像分析系统(日本Olympus)；Finesse325石蜡切片机(英国Shando)；Bx51光学显微镜(日本Olympus)；手握式电动匀浆机(德国FLUKO)；3K15低温冷冻离心机(美国Sigma)；7300RealtimePCR检测仪(美国ABI)。
2方法
2.1动物模型的制备及评价参照文献方法采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血大鼠模型[910]。假手术组不插入鱼线，仅切开皮肤、分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉后即缝合。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒内，自由饮水、进食。动物于清醒后2h参照Longa[11]的5分制法进行神经功能评分，分值在1～3分者入组，动物清醒后爬行时向右转圈(追尾现象)，严重时向右跌倒，提尾时右前肢内收屈曲提示造模成功。
2.2分组及给药将SD大鼠分为假手术组和MCAO手术组。MCAO手术组大鼠根据术后神经功能评分情况分层随机分为模型组(不给药)、补阳还五汤给药组、脑健片给药组，每组各50只(分1，3，7，14，28d5个时间点，每个时间点10只，其中5只用于免疫组化、5只用于RTPCR)。均于手术后第1天开始给药，每日1次，模型组和假手术组动物均灌胃等体积无菌蒸馏水，自由饮食、活动。药物干预组给药剂量根据前期剂量筛选实验[3]，将补阳还五汤及其精简方设高、中、低剂量组，考察不同剂量药物对MCAO大鼠脑水肿、梗死面积及体质量的影响，结果显示补阳还五汤组以干浸膏3.15g·kg-1灌胃和补阳精简方组以干浸膏2.41g·kg-1灌胃疗效最佳，与模型组比有统计学差异(P<0.05)。 (刘芳 王宇红 蔡光先 佘颜 邵乐 夏相宜)