双阻滞位点特异性PCR鉴别铁皮石斛及其近缘物种(1)
[摘要]建立一种快速、准确鉴别铁皮石斛加工制品的方法。该研究通过对GenBank数据库收录的铁皮石斛及其同属近缘物种的ITS序列进行对比分析，根据变异位点设计双阻滞位点特异性鉴别引物，并优化PCR条件，对铁皮石斛及其69种近缘种共362个样品进行扩增和检测。结果显示，在退火温度为60 ℃的同一PCR反应中，铁皮石斛均扩增出397 bp条带，而其他69种近缘物种均无条带，且该方法灵敏度高，检出限可达0.03 mg·L-1。该文所建立的位点特异性PCR方法可实现铁皮石斛的准确鉴别，具有操作简便、稳定可靠、应用范围广的优点。
[关键词] 铁皮石斛； 位点特异性PCR； 分子鉴定
[Abstract] Based on rDNA ITS sequences of Dendrobium officinale and the other 69 species of Dendrobium， a pair of dismatched allele-specific diagnostic primers， TPSH-AS1F and TPSH-AS1R were designed to authenticate D. officinale from the other species. Thebidirectional PCR amplification were performed using the diagnostic primers with the total DNAs of the original plants or processing products as a template. When the annealing temperature was raised to 60 ℃， only the template DNA of D. officinale could be amplified whereas the diagnostic PCRs of the other Dendrobium species were all negative. Compared with the other authentification methods， the bidirectional PCR amplifications is not only simpler and time-saving but practical and effective.
, http://www.100md.com
[Key words] Dendrobium officinale； PCR amplificationof specificalleles； molecularidentification
近20年來，分子鉴别技术尤其是特异性PCR鉴别已广泛用于食品和中药的真伪鉴别。作为特异性PCR的发展性技术，位点特异性PCR(allele-specific PCR)、扩增阻滞突变系统及其衍生方法利用引物末端不完全匹配形成的扩增阻滞差异，已能够对单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点差异进行分型从而实现近缘物种的鉴别[1-3]。但位点特异性PCR鉴别在设计引物时需要选择适宜的GC含量且尽量不含有重复序列，PCR扩增时也需要严谨的反应条件，因退火温度、酶量、引物量、循环数、模板浓度、Taq酶种类均可影响SNP分型结果，导致该方法应用推广受限[4]。
对一些难以进行基因分型的近缘物种，需要建立更加稳定的鉴别方法。铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是石斛属石斛组药用植物，同组有30余个近缘物种，其形态和化学成分相似，传统手段鉴别困难。核糖体ITS序列在部分石斛种间存在极其显著的差异，且在种内具有一定的遗传稳定性，多个石斛属物种均有各自特异性SNP位点，是石斛物种鉴别的有效DNA分子标记[5-9]。但核糖体DNA多为高重复串联序列，且具有很高的GC含量，设计的位点特异性PCR引物需要非常严格的PCR反应条件[10-12]。为解决这一问题，本文在完成亚洲大陆石斛属分子系统学研究的基础上，以铁皮石斛为研究材料，利用石斛属ITS区变异丰富的特点，通过2个SNP位点设计1对均在3′端倒数第2位引入错配碱基的双阻滞特异性引物，使得仅铁皮石斛出现阳性条带，而石斛属其余69种物种均无条带，为铁皮石斛与近缘物种的鉴别提供了分子依据。
, 百拇医药
1 材料
1.1 植物材料 选取来自不同产地的铁皮石斛168个单株和69种194个石斛属近缘物种的茎362个DNA样品进行位点特异性PCR研究。植物样品采自我国安徽、云南、广西、浙江、重庆、贵州、西藏、海南、台北等省市，以及尼泊尔、老挝、越南和泰国，分别由安徽中医药大学俞年军教授和中国科学院植物研究所金效华博士鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。
1.2 仪器 VeritiTM 96孔梯度PCR仪(Applied Biosystems公司)；GeneAmp 9700型PCR仪(Applied Biosystem公司)；TC-512梯度PCR仪(TECHNE公司)；5810R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司)； DYY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂)； SYNGENE凝胶成像系统(GENE公司) 。
1.3 试剂 rTaq DNA聚合酶、SpeedSTAR HS TaqDNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、DL 2 000 DNA Marker购自TaKaRa公司； 2× High-Fidelity Master Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司。, http://www.100md.com(董晓曼 蒋超 袁媛 查良平 彭代银 赵玉洋)
[关键词] 铁皮石斛； 位点特异性PCR； 分子鉴定
[Abstract] Based on rDNA ITS sequences of Dendrobium officinale and the other 69 species of Dendrobium， a pair of dismatched allele-specific diagnostic primers， TPSH-AS1F and TPSH-AS1R were designed to authenticate D. officinale from the other species. Thebidirectional PCR amplification were performed using the diagnostic primers with the total DNAs of the original plants or processing products as a template. When the annealing temperature was raised to 60 ℃， only the template DNA of D. officinale could be amplified whereas the diagnostic PCRs of the other Dendrobium species were all negative. Compared with the other authentification methods， the bidirectional PCR amplifications is not only simpler and time-saving but practical and effective.
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[Key words] Dendrobium officinale； PCR amplificationof specificalleles； molecularidentification
近20年來，分子鉴别技术尤其是特异性PCR鉴别已广泛用于食品和中药的真伪鉴别。作为特异性PCR的发展性技术，位点特异性PCR(allele-specific PCR)、扩增阻滞突变系统及其衍生方法利用引物末端不完全匹配形成的扩增阻滞差异，已能够对单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点差异进行分型从而实现近缘物种的鉴别[1-3]。但位点特异性PCR鉴别在设计引物时需要选择适宜的GC含量且尽量不含有重复序列，PCR扩增时也需要严谨的反应条件，因退火温度、酶量、引物量、循环数、模板浓度、Taq酶种类均可影响SNP分型结果，导致该方法应用推广受限[4]。
对一些难以进行基因分型的近缘物种，需要建立更加稳定的鉴别方法。铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是石斛属石斛组药用植物，同组有30余个近缘物种，其形态和化学成分相似，传统手段鉴别困难。核糖体ITS序列在部分石斛种间存在极其显著的差异，且在种内具有一定的遗传稳定性，多个石斛属物种均有各自特异性SNP位点，是石斛物种鉴别的有效DNA分子标记[5-9]。但核糖体DNA多为高重复串联序列，且具有很高的GC含量，设计的位点特异性PCR引物需要非常严格的PCR反应条件[10-12]。为解决这一问题，本文在完成亚洲大陆石斛属分子系统学研究的基础上，以铁皮石斛为研究材料，利用石斛属ITS区变异丰富的特点，通过2个SNP位点设计1对均在3′端倒数第2位引入错配碱基的双阻滞特异性引物，使得仅铁皮石斛出现阳性条带，而石斛属其余69种物种均无条带，为铁皮石斛与近缘物种的鉴别提供了分子依据。
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1 材料
1.1 植物材料 选取来自不同产地的铁皮石斛168个单株和69种194个石斛属近缘物种的茎362个DNA样品进行位点特异性PCR研究。植物样品采自我国安徽、云南、广西、浙江、重庆、贵州、西藏、海南、台北等省市，以及尼泊尔、老挝、越南和泰国，分别由安徽中医药大学俞年军教授和中国科学院植物研究所金效华博士鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。
1.2 仪器 VeritiTM 96孔梯度PCR仪(Applied Biosystems公司)；GeneAmp 9700型PCR仪(Applied Biosystem公司)；TC-512梯度PCR仪(TECHNE公司)；5810R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司)； DYY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂)； SYNGENE凝胶成像系统(GENE公司) 。
1.3 试剂 rTaq DNA聚合酶、SpeedSTAR HS TaqDNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、DL 2 000 DNA Marker购自TaKaRa公司； 2× High-Fidelity Master Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司。, http://www.100md.com(董晓曼 蒋超 袁媛 查良平 彭代银 赵玉洋)