中药仙鹤复方水提取物对肝癌H22细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制(2)
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1 材料与方法
1.1 实验材料：(1)主要试剂：中药仙鹤复方原料购自惠州市卫康医药有限公司，我院药剂科中药师鉴别确认，其水提取物由珠海市联邦医药有限公司GMP实验室提供(要求每毫升相当于3.60g生药药液)，并再分别稀释成1.80g/ml和0.9g/ml，共3种溶液。置4℃冰箱备用。胰蛋白酶、Trizol、尼美舒利(nimesulide，NS)及二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司；DNA试剂盒购自美国Qiagen公司；Hoechst33342购自鼎国生物工程公司；(2)H22肝癌细胞株由天津药物研究院提供。
1.2 细胞培养：细胞生长在含100 U/mL青霉素、100U/mL链霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养箱内条件为37℃、5%CO2和95%的空气，每2-3 天传代一次。取对数生长期细胞用于实验。肝癌细胞用含体积分数10%小牛血清的RPMI1640培养液常规培养。
1.3 四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖情况：用培养液将细胞制成2×108/L细胞混悬液，接种于96孔板，每孔200μL，24小时后随机分为4组：分别加入终浓度为0、0.9g/ml、1.80g/ml和3.60g/ml中药仙鹤复方水提取物的培养液，每组设6个复孔；分别作用24、48、72h后每孔加新配置的0.5%MTT贮存液20μl，继续培养4h，弃上清液后每孔加150μlDMSO溶解细胞内结晶，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度(A)值 ......
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