猪脑蛋白水解物中小分子肽的制备及生物活性测定
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【摘要】 目的 从猪脑中制备不同分子量范围的小分子肽组份，测定各组份的生物活性。方法 (1)猪脑经脱脂、酶解、Sephadex G15凝胶过滤制备小分子肽。(2)采用东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障碍模型，通过小鼠被动回避跳台实验测定组份的生物活性。结果 (1)得到A1～A5五个小分子肽组份。(2)分别给药A4、A5的两组小鼠潜伏期和错误次数与模型组差异显著(P<0.05)。结论 组份A4、A5具有明显的生物活性，能显著改善记忆获得障碍小鼠的学习记忆能力。
【关键词】 猪脑蛋白水解物；小分子肽；跳台实验
动物脑蛋白水解物可用于治疗一些脑功能性疾病，近年来人们对其进行了大量研究，并有众多的脑蛋白水解物产品涌入临床，其中奥地利依比威药厂(Ebewe)生产的脑活素注射液已有40年的历史，临床应用最为广泛。国内外众多学者对脑活素的药理活性给予充分的肯定[1，2]。脑活素临床上可用于神经系统疾病特别是阿尔茨海默氏病(AD)的治疗[3-5]，能明显延缓老年痴呆病变的进展，改善痴呆症状。还可用于脑中风、脑震荡、脑损伤、脑动脉硬化、新生儿缺血缺氧性脑病等许多脑部疾病的治疗。脑活素1989年进入中国市场并以其良好的疗效广泛应用到临床。脑活素是由猪脑蛋白经水解进一步提取制得的生物制剂，含有75%的游离氨基酸和25%的小分子肽。研究表明脑活素的药理作用与其含有的小分子肽类的多种生物活性有关[6]，因此对制备和研究动物脑组织水解物中小分子肽具有重大意义。
1 材料与方法
1.1 材料 猪脑(市场购得)，昆明种小鼠(中国药品生物制品检定所提供)，Sephadex G15(Amersham Bioscience)。
1.2 试药与试剂 酸性蛋白酶(肇东市北方酶制剂有限公司25 000 U/g)，生理盐水(石家庄制药集团有限公司)，氢溴酸东莨菪碱注射液(上海禾丰制药有限公司，0.3 mg/ml)，其他化学试剂均为分析纯。
1.3 仪器 WatersTM650E蛋白纯化系统(Waters公司)，Virtis AD2.0ES冻干机(the Virtis Company)，JXDT1型小动物跳台仪(冀星实验仪器有限公司)。
1.4 方法 (1)小分子肽的制备：新鲜猪脑去膜、去血管，洗净后切成小块，放入索氏提取器内，用丙酮回流12 h后，取出压碎晾干，再用丙酮回流12 h，所得固形物再用乙醚按上法回流提取共24 h，晾干后即得到猪脑脱脂蛋白粉。猪脑脱脂蛋白粉与5倍的水混合，加入猪脑脱脂蛋白粉重量2%的酸性蛋白酶，混匀后用冰醋酸调pH值至2.00±0.05，50℃连续水解36 h，并保持pH值在2.0～4.0，过滤，滤液50℃减压蒸干后，分别用石油醚和无水乙醇搅拌24 h，抽滤，滤饼真空干燥即得猪脑蛋白水解物。水解产物用Sephadex G15凝胶柱，以0.9% NaCl为洗脱液进行分离纯化，分段收集各流份并脱盐，冷冻干燥后即可得到不同分子量范围的小分子肽组份。(2)对小鼠学习记忆的影响：取小鼠70只，体重19～21 g，雌雄兼用，随机分成7组，每组10只。正常对照组和模型对照组均腹腔注射生理盐水，其余5组分别按剂量150 mg/kg腹腔注射所制得的样品。连续注射7 d，每天1次。末次给药30 min后，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余6组按剂量3 mg/kg腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液。30 min后在跳台仪中训练测试。先让小鼠熟悉跳台仪环境3 min，然后通以36 V电压，小鼠受到电击后会跳上跳台逃避。跳下时以小鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应。训练5 min，观察和记录小鼠跳上跳台的时间和5 min内的错误次数作为学习指标。24 h后重作测试，测时先将小鼠放置在跳台上，同时开动秒表记录小鼠第1次跳下的时间，此为触电潜伏期，同时记录5 min内跳下跳台次数(错误次数)，若5 min内小鼠没有从跳台上跳下，则潜伏期记为300 s，错误次数记为0，潜伏期和错误次数作为记忆指标。训练和测试均在下午同一时间内进行，各组动物交叉进行[7]。
15 统计学处理 测定数据以±s表示，采用t检验统计处理。P<0.05为差异有显著性。
2 结果与讨论
2.1 脱脂蛋白粉及酶解产物的收率 1 800 g新鲜猪脑共制得脱脂蛋白粉67 g，收率为3.7%。脱脂蛋白粉的酶解收率为31.2%。经过凝胶过滤共收集到5个组份，此步的收率为94.5%。直接用去离子水洗脱，可以省去脱盐步骤，操作简单，但是用去离子水洗脱只收集到4个组份，且收率仅为79.4%，这可能与用纯水洗脱时，Sephadex凝胶对某些蛋白的非特异性吸附有关，因此本实验采用0.9% NaCl溶液洗脱。
2.2 对小鼠学习记忆影响的测定结果 对各组动物的触电潜伏期和错误次数进行t检验，结果表明模型对照组与空白对照组比较，潜伏期明显缩短，5 min内错误次数明显增加(P<0.01)，说明所造的记忆获得障碍模型成功，见表1。
表1 跳台实验结果(略)
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01A1、A2组与模型对照组比较，潜伏期和5 min内的错误次数差异均无显著性(P>0.05)，这说明组份A1、A2不具有显著的学习和记忆改善作用。A3组与模型对照组比较，潜伏期明显延长(P<0.05)，但错误次数没有显著减少(P>0.05)，这一结果表明组份A3学习和记忆改善作用尚不能肯定。A4、A5组与模型对照组比较，潜伏期明显延长(P<0.05，P<0.01)，错误次数显著减少(P<0.05，P<0.01)，说明其能明显增强记忆障碍小鼠的学习记忆能力。虽然A1和A2组与对照组差异无显著性，但两组的潜伏期均有所延长，5 min内的错误次数均有所减少。本文以新鲜健康猪脑为原料，采用酸性蛋白酶水解，Sephadex G15凝胶过滤方法对酶解产物进行分离纯化，得到5个小分子肽组份，并对其生物活性进行测定，这对进一步研究小分子肽的结构以及临床用药的质量控制都有积极意义。
参考文献
1 Koroleva VI,Korolev OS,Mares V,et al.Hippocampal damage induced by carbon monoxide poisoning and spreading depression is alleviated by chronic treatment with brain derived polypeptides.Brain Res,1999,816:618627.
2 Ruben JB,Dafang Wu,Manfred W.In vivo upregulation of the bloodbrain barrier GLUT1 glucose transporter by brainderived peptides.Neurosci Res,1999,34:217224.
3 Ruether E,Moessler H,Windisch M.The MADB studyA randomized doubleblind placebocontrolled trial with cerebrolysin in Alzeimer's disease.Eur Neuropsychopharm,2000,10:S355.
4 Rainer M,Moessler H.Cerebrolysin in the treatment lf dementia:Openlabel study with a neurotrophic agent.Eur Neuropsychopharm,2000,10:S355S356.
5 Ruether E,Gmeinbauer R,Windisch M.Followup investigation in patients with Alzheimer's disease 24 weeks after termination of cerebrolysin therapy.Eur Neuropsychopharm,2000,10:S357S358.
6 Hartbauer M,HutterPaiter B,Skofitsch G,et al.Antiapoptotic effects of the peptidergic drug Cerebrolysin on primary cultures of embryonic chick cortical neurons.J Neural Transm,2001,108:459473.
7 Makoto U,Tetsuya K,Norihiro S,et al.Dynorphin A(113) potently improves scopolamineinduced impairment of passive avoidance response in mice.Eur J Pharmacol,1995,274:8993.
作者单位： 050015 石家庄市，华北制药集团新药研发公司
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