当前位置: 首页 > 期刊 > 《右江医学》 > 2010年第5期 > 正文
编号:11964950
阿托伐他汀干预对大鼠心肌缺血再灌注后GRP78和GADD153表达的影响(1)
http://www.100md.com 2010年10月1日 刘忠仁,王若琦,蓝景生,谭志辉
第1页

    参见附件(2070KB,4页)。

     【摘要】 目的 观察阿托伐他汀干预对大鼠心肌缺血再灌注损伤后内质网分子伴侣GRP78(endoplasmic reticulummolecular chaperon)和GADD153 (growth arrest and DNA damageinducible gene 153)表达变化的影响,探讨阿托伐他汀在心肌缺血再灌注损伤后抗凋亡的内质网应激机制。

    方法将54只SD大鼠随机分为阿托伐他汀干预组24只、模型对照组24只和假手术组6只,制作大鼠心肌再灌注损伤模型。阿托伐他汀干预组和模型对照组再灌注2 h、6 h、24 h、48 h分别分为4个亚组,每个亚组动物6只。通过TUNEL检测心肌细胞凋亡,免疫组织化学检测GRP78和GADD153表达变化。结果 假手术组大鼠偶可见凋亡细胞,对照组和干预组大鼠缺血再灌注2 h缺血周围区可见少量凋亡细胞,再灌注6 h凋亡细胞有所增多,再灌注24 h凋亡细胞数量达高峰,再灌注48 h凋亡细胞有所减少(P<0.05或0.01)。相同各时间点比较,干预组大鼠心肌细胞凋亡显著少于对照组(P<0.05或0.01)。假手术组大鼠心尖部相应区域心肌细胞未见明显GRP78 及GADD153阳性表达。对照组和干预组大鼠再灌注2 h后心尖部GRP78表达开始增加,6 h达高峰,24 h时表达水平明显下降(P<0.01)。在相应时间点,干预组的GRP78蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01)。对照组和干预组大鼠缺血周围区GADD153从再灌注6 h开始在神经细胞内明显表达,并逐渐增强,于再灌注24~48 h达高峰(P<0.01)。在相应时间点,干预组的GADD153蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.01)。结论干预心肌缺血再灌注后心肌细胞内质网伴侣GRP78和GADD153的表达可能是阿托伐他汀抑制心肌缺血再灌注损伤后抗凋亡的内质网应激机制之一。

    【关键词】 阿托伐他汀;GRP78;GADD153;细胞凋亡;缺血再灌注损伤

    文章编号:1003-1383(2010)05-0517-04 中图分类号:R 541.4 文献标识码:A

    doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.05.001

    早期溶栓和急诊冠状动脉介入(急诊PCI)是治疗急性心肌梗死(AMI)最有效方法,能使梗死相关血管再通,缺血心肌得到再灌注,缩小梗死面积,改善预后。然而,心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)后常常出现的损伤影响了再灌注的疗效。已有研究证实,心肌缺血再灌注时诱导的细胞凋亡是急性心肌I/R损伤的主要形式[1]。内质网应激(ER stress,ERS)启动的途径是近年发现的一种新的凋亡途径,Nickson等[2]研究发现ERS参与I/R心肌损伤的病理过程。阿托伐他汀是羟甲基戊二酰辅酶A(hydroxymethylglutaryl coenzyme a reductase inhibitor,HMGCoA)还原酶选择性抑制剂,为高效广谱他汀类降脂药物。阿托伐他汀用于心肌梗死治疗的机制除了与调脂作用有关外,还与抑制细胞凋亡等相关[3],其抑制心肌缺血再灌注后细胞凋亡具体机制目前尚未完全阐明。本研究通过观察阿托伐他汀干预对内质网分子伴侣GRP78和GADD153[4]的表达影响,探讨其抑制缺血再灌注后细胞凋亡的内质网应激机制。

    材料与方法

    1.动物及分组 健康清洁级雄性SD大鼠54只,体重280~330 g,购自广西医科大学动物实验中心(许可证号:SCXK桂20030003),随机分为干预组24只,给予阿托伐他汀(商品名立普妥,辉瑞制药公司)灌喂20 mg•kg-1•d-1干预,对照组24只,给予0.9%氯化钠溶液灌喂2 ml/d,假手术组6只给予0.9%氯化钠溶液灌喂2 ml/d。三组灌喂3 d后制作大鼠心肌I/R模型。阿托伐他汀干预组和模型对照组再灌注2 h、6 h、24 h、48 h分别分为4个亚组,每个亚组动物6只。

    2.大鼠心肌缺血再灌注模型的制作 参照Bimbaum法[5]制作缺血再灌注模型,即大鼠以水合氯醛(35 mg/100g体重)腹腔注射麻醉,观察呼吸及反应,稳定后固定于手术台。接心电图机,实验过程中动态观察并记录Ⅱ导联心电图,保持大鼠自然呼吸状态。气管插管,接人工呼吸机(频率55次/min潮气量115 ml/100 g)后。开胸,于冠状动脉左前降支起始0.2 cm处穿线,待呼吸、血压平稳15 min后,用一硅胶管垫于血管和结扎线之间结扎,假手术组仅穿线不结扎。30 min后剪开结扎线。制模成功的标志:结扎线远端心肌颜色紫绀,心电图表现为R波高耸或ST段抬高,松开结扎线后缺血部位心肌颜色恢复,抬高的ST段下降。

    3.TUNEL法检测心肌细胞凋亡 采用TUNEL(试剂盒购于博士德公司)法进行检测。各组(亚组)大鼠再灌注后相应时间点麻醉、开胸,取左室前壁中间段梗死区边缘心肌组织0.5 cm×0.1 cm×0.1 cm,10%甲醛室温固定,常规石蜡包埋、切片、脱蜡至水后,专人严格按TUNEL试剂盒说明书操作。中型树胶封片,显微镜下观察;在400倍镜下,计算10个不重叠视野TUNEL阳性细胞比例的平均值,并以百分数(%)表示凋亡指数(Apoptotic Index,AI)。

    4.免疫组化检测GADD153和GRP78蛋白表达 各组(亚组)大鼠再灌注后相应时间点麻醉、开胸,取心尖部约0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm,10%甲醛室温固定,常规石蜡包埋切片。采用SABC法检测GRP78和GADD153蛋白表达,按试剂说明操作。具体是:石蜡切片常规脱蜡至水,0.3%H2O2室温孵育10 min封闭内源性过氧化物酶,蒸馏水洗三次,将切片浸入0.01 M枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0),微波炉中加热至沸腾后断电,间隔5 min后反复1次,室温自然冷却,PBS(pH 7.2~7.6)洗两次。滴加5%BSA封闭液,室温留置?20 min,甩去多余液体,不洗。滴加稀释1∶100的一抗(GRP78羊抗多克隆抗体、GADD153兔抗多克隆抗体购自Santa Cruz公司),4℃过夜,PBS(pH 7 ......

您现在查看是摘要介绍页,详见PDF附件(2070KB,4页)