牛奶中青霉素残留量检测的方法学探索①(2)
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2010年8月1日
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参见附件(2206KB，3页)。
1.3.2 磷酸二氢钾缓冲溶液0.1mol/L(pH=2.5),流动相(磷酸二氢钾:乙腈=7:3),置于4℃冰箱保存,备用。青霉素标准溶液0.1mg/mL,现配现用。
1.4 样品前处理方法
吸取3mL牛奶到15mL塑料离心管中,加入6mL乙腈,漩涡混匀10s,然后4000r/min离心5min,吸取上清液过滤到50mL圆底烧瓶,于40℃减压条件下旋转浓缩至干,用精密移液枪定量加入3mL流动相,使其溶解,最后经0.45μm微孔滤膜过滤至进样瓶中,上机待测。
1.5 定量检测方法
牛奶中青霉素的含量采用外标法[17]计算,该方法是将已知青霉素含量的标准溶液加至空白牛奶中,配成不同浓度梯度的牛奶样品,按1.4项下的样品前处理方法进行处理后,检测得到的峰面积与配制的青霉素浓度在一定范围内成正比。用峰面积对配制的青霉素浓度绘制标准曲线,计算回归方程,然后将被测样品的峰面积代入回归方程中,求出青霉素的含量。
1.6 色谱条件
色谱柱:AgilentEclipse XDB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾(pH为2.5)—乙腈(70:30,V/V),检测波长:225nm,流速1mL/min,柱温(20℃),进样量10μL 。
2 实验方法
2.1 特异性
在1.6项色谱条件下,测定青霉素类抗生素的保留时间,以及系统适应性指标(分离度、理论塔板数、拖尾因子)是否达到相应要求。
2.2 标准曲线与线性范围
吸取浓度为0.1mg/mL的标准溶液适量,分别加入到3mL空白牛奶中,配制成2、4、6、7、9、11(μg/mL)的不同浓度梯度,每个浓度样品按1.4项下的处理方法处理后,以10μL各样双针上机检测。以测得的各浓度的色谱峰面积平均值与配制的青霉素浓度进行线性回归分析,制定标准曲线,得出线性回归方程,并以标准曲线的线性范围最低检测浓度为最低定量限。
2.3 仪器检测限与方法最低检测限
以流动相为溶剂,配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 ng/mL一系列不同浓度的青霉素标准溶液,在 1.6 项色谱条件下,上机测定仪器最低检测限。以信噪比为3:1时相应的浓度,确定方法最低检测限,具体方法为配制1、2、3、4、6、8 ng/mL一系列不同浓度的牛奶样品,分别按 1.4 项下的处理方法进行处理后,上机检测本方法对牛奶中青霉素残留浓度的最低检测限。
2.4 精密度的测定
根据标准曲线的线性范围,配制低(接近最低定量限)、中(中间)、高(接近上限)3个质控浓度,每个浓度6个样品,与随行标准曲线同法测定。即分别吸取浓度为0.1mg/mL的青霉素标准溶液90μL、210μL、300μL,分别加入到2.910mL、2.790mL、2.700mL空白牛奶中,配制成低(3μg/mL)、中(7μg/mL)、高(10μg/mL)3个质控浓度的牛奶样品,每个样品均按1.4项下的样品前处理方法进行处理后,以10μL各样双针上机检测。计算色谱峰面积平均值,分别代入线性回归方程,计算出测定浓度,以测定浓度计算出相对标准偏差(RSD)来评价本方法的精密度。
相对标准偏差=标准偏差(S)/测定浓度平均值()×100%[18]。
2.5 回收率的测定
根据标准曲线的线性范围,配制低、中、高3个质控浓度,每个浓度6个样品,与随行的标准曲线同法测定。即:分别吸取浓度为0.1mg/mL的青霉素标准溶液90μL、210μL、300μL,分别加入到2.910mL、2.790mL、2.700mL空白牛奶中,配制成低(3μg/mL)、中(7μg/mL)、高(10μg/mL)3个质控浓度的牛奶样品,每个样品均按1.4项下的样品前处理方法进行处理后,以10μL各样双针上机检测。计算色谱峰面积平均值,分别代入线性回归方程,计算出测定浓度,以测定浓度与配制浓度相比,计算得回收率(RR)。
回收率=测定浓度/配制浓度×100%[19]。
2.6 稳定性的测定
在标准曲线的线性范围内,配制低(3μg/mL)、中(7μg/mL)、高(10μg/mL)3个质控浓度,即分别吸取浓度为0.1mg/mL的标准溶液90μL、210μL、300μL,分别加入到2.910mL、2.790mL、2.700mL流动相中,配制成3μg/mL、7μg/mL、10μg/mL,3个质控浓度,每个浓度分别置于室温(20℃)和冰箱(4℃)条件下,并在第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时处,各双针进样检测。
3 结果
3.1 特异性
在本色谱条件下,测得青霉素类抗生素的保留时间均约为5.88min。青霉素与杂质峰的分离度大于 2.0,理论塔板数以青霉素计大于2000,青霉素峰的拖尾因子小于2.0,因此各系统适应性指标均达到相应要求。青霉素标准对照品的色谱图见图1。
3.2 标准曲线制定
牛奶中添加青霉素浓度分别为2、4、6、7、9、11μg/mL时,测定结果见表1,标准曲线见图2,得线性回归方程为:y=2.6470 x+0.1542,r=0.9945,最低定量限为2μg/mL 。
3.3 仪器检测限与方法最低检测限
以信噪比为3:1时相应的浓度确定最低检测限。标准液在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ng/mL时均未检出,在0.8ng/mL时检出,因此仪器检测限为0.8ng/mL。检测方法最低检测限时,1、2、3、4、6 ng/mL均未检出,8ng/ml检出,因此本方法对牛奶中的青霉素的最低检测限为ng/mL 。
3.4 精密度
牛奶中添加青霉素浓度为3、7、10μg/mL时,测定结果见表2。
3.5 回收率
牛奶中添加青霉素浓度为3、7、10μg/mL时,测定结果见表2。
3.6 稳定性
在标准曲线范围内配制低3(μg/mL)、中(7μg/mL)、高(10μg/mL)三个质控浓度,分别在20℃和4℃条件下,不同时间测得的峰面积及其4小时保留率、10小时保留率、10小时相对标准偏差(RSD)见表3 ......
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