脐血血浆对T淋巴细胞增殖\分化的影响续一连(2)
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2011年11月1日
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增殖指数(SI)=实验组OD值/对照组OD值×100%
1.7 免疫组织化学染色法(immunohistochemical staining,IHS)测定诱导T淋巴细胞亚群
收集诱导后细胞滴于印孔载玻片上，自然干燥后用4℃冷丙酮固定；3%H2O2-甲醇37℃孵育10 min，以封闭过氧化物酶；分别滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8单抗，4℃过夜；滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育20 min；DAB显色，室温5～15 min；封片，镜检。高倍镜下随机选取视野，计数200个细胞，细胞膜表面有棕色标记物为阳性细胞，计算出阳性率。
1.8 统计分析
采用SPSS13.0统计软件包处理，所有数据以均数±标准差(x±s)或百分率(%)表示，总体采用方差分析(F检验)，多个样本两两比较采用SNK法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 光镜下形态观察
光镜(light microscope,LM)下，脐血单个核细胞，呈圆球形，细胞饱满，折光性强。培养72 h，可见大部分细胞成悬浮生长，聚集成团。PHA组细胞团密集、呈较规则球形；CBP+PHA组细胞团较松散，形状不规则。
2.2 MTT比色法检测不同试验条件对脐血源性T淋巴细胞的增殖作用
不同实验条件下培养72 h T淋巴细胞增殖指数：PHA组(1.48±0.49)，CBP+PHA组(1.21±0.29)与生理盐水组比较均有统计学意义(P<0.05)；CBP+PHA组与PHA组比较无统计学意义(P>0.05)(表1)。
表1 MTT比色法检测不同试验条件对脐血源性T淋巴细胞的
增殖作用(x±s)
* vs control P<0.05
2.3 免疫组织化学染色与图像分析
T淋巴细胞CD3、CD4、CD8分子呈棕色，均表达于T淋巴细胞膜上。不同实验条件诱导第72 h时 CD3、CD4、CD8的阳性表达率：CBP+PHA组CD4、CD8阳性率与PHA组比较均有统计学意义(P<0.05)；CBP+PHA组CD3阳性率与PHA组比较无统计学意义(P>0.05)(表2)。
表2 不同实验条件诱导72hT淋巴细胞CD3、CD4、CD8的阳性表达率(%)
* vs control P<0.05； # vs PHA P>0.05；△ vs PHA P<0.05
3 讨论
CBP含有丰富的造血刺激因子，能有效扩增脐血造血干/祖细胞并提高脐血中粒细胞巨噬细胞集落形成单位(colony-forming unit-granulocyte macrophage,CFU-GM)增殖能力[6] ，增强骨髓造血干/祖细胞的自我更新和增殖能力[7]。临床上已应用CBP这一特性治疗再生障碍性贫血，并取得了较好的疗效，同时CBP对白血病也有一定的辅助治疗作用[8]。彭晓等[9]等发现在免疫效应细胞CD3单抗激活的杀伤细胞(anti-CD3 antibody induced activated killer,CD3AK)的培养中混合CBP与成人AB血清具有相似的效果，故利用混合CBP培养脐血源性T淋巴细胞的设想具有一定的可行性。且脐血血浆获取方便、ABO 血型抗原性弱，如能取代人工合成的培养基进行细胞培养，不仅能变废为宝、节省资源，还可望能提高免疫细胞增殖能力和杀伤活性，增强过继免疫治疗效果。我们的研究结果初步显示混合脐血血浆对脐血源性T淋巴细胞增殖影响不明显，可能与RPMI1640培养体系具有相似的效果，但其诱导的CD4+、CD8+ T淋巴细胞低于PHA组，其原因有待于更进一步的研究。
参考文献
[1] 周永春.脐带血单个核细胞体外诱导成CIK细胞及其抗肿瘤效应的实验研究[D].昆明医学院,2004.
[2] 何跃东,彭芝兰,刘兴会,等.脐血来源的细胞毒性T淋巴细胞对人卵巢癌裸鼠移植瘤治疗的研究[J].实用妇产科杂志,2005,21(5):287-289.
[3] 王晓阳,李熙鸿,王世有.脐血血浆辅组环胞霉素A治疗再生障碍性贫血临床观察[J] ......
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