低中剂量乙醇对培养大鼠心室肌乳酸脱氢酶2作用的研究(2)
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参见附件(4129KB，5页)。
1.2.5 统计分析
图片应用Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析；应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，所有数据均用平均值 标准差(means SD)表示，以 α = 0.05为检验水准，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫荧光心肌细胞鉴定
胰酶分次消化分离心肌细胞，未贴壁时为圆形或椭圆形，24 h后可见心肌细胞贴壁，伸展成为长杆形、多角形、梭形或不规则三角形等形态，核呈卵圆形并居中，胞体有明显的折光性，立体感强，并有个别心肌细胞非同步化跳动。48~72 h各细胞突起呈分枝相连成簇状或片状，并可见心肌细胞同步化搏动。经α-MHC单抗组化染色鉴定，心肌细胞纯度达90 %以上(图1)。
2.2 不同浓度乙醇干预对缺氧诱导心肌细胞凋亡的流式细胞检测
不同乙醇浓度干预心肌细胞后给予缺氧诱导凋亡，检测结果显示：乙醇对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的作用呈剂量依赖性；与未干预组相比，5 mmol/L和10 mmol/L组凋亡(包括早晚期)明显降低(0.227 ± 0.058，0.194 ± 0.075 vs. 0.375 ± 0.107)，并有显著性差异(P = 0.049，0.020)，15 mmol/L，20 mmol/L，30 mmol/L组和对照组相比没有明显差异(0.264 ± 0.073，0.313 ± 0.051，0.362 ± 0.114；P>0.05)(图2)。
2.3 不同浓度乙醇干预心肌细胞ALDH2表达变化
心肌细胞免疫荧光结果显示：在低中剂量范围内，ALDH2蛋白表达随乙醇浓度增加有升高趋势(图3，4)。
3 讨论
低中剂量饮酒定义为男性每人每天2杯，女性1杯(常规啤酒355 ml，白酒118 ml，蒸馏酒44 ml，日本米酒113 ml定义为1杯[2])，就绝对量而言乙醇的量为< 30 g/d。Rimm[3]等研究发现：中等剂量(30 g/d)乙醇能够使冠心病的危险因素下降24.7%。研究表明[4]：在0～20 g/d剂量冠心病危险因素是逐渐减低的，但高于89 g/d时则使冠心病的危险因素明显增加。
3.1 低中剂量乙醇对缺氧诱导心肌细胞凋亡的影响
心肌细胞凋亡在缺血再灌注损伤和心力衰竭的发生和发展中发挥了重要作用[5]。抑制心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注和心力衰竭心肌保护的重要方法。研究表明[6]低剂量乙醇明显抑制脂肪酸诱导心肌细胞凋亡发挥心肌保护作用。本实验研究发现：乙醇的浓度与缺氧诱导心肌细胞凋亡之间呈现一种U型关系；乙醇在5 mmoL/L时就已经可以对缺氧诱导的心肌细胞凋亡产生抑制作用，10 mmoL/L时最强。与流行病学研究的结果相似[7]。Miyamae[8]等在新几内亚猪心肌保护作用的乙醇浓度为2mmol/L。Chen[9]等证实给予10～50 mmoL/L乙醇能够对离体大鼠心肌缺血损伤产生保护作用。Genevieve[6]等发现采用10 mmol/L乙醇可以抑制脂肪酸诱导的大鼠心肌细胞凋亡，与本研究结果一致。
3.2 低中剂量乙醇对心肌细胞ALDH2表达的影响
研究[10,11]显示ALDH2对神经细胞产生保护作用，抑制乙醛诱导的人脐静脉内皮细胞、高氧诱导的肺上皮细胞和乙醛或缺氧诱导的心肌细胞凋亡。在人外周血细胞和肝细胞的研究中发现[12]，乙醇或乙醛可以明显提高ALDH2 mRNA水平。Churchill[13]等研究发现乙醇可以间接激活ALDH2发挥心肌保护作用。本研究发现给予心肌细胞乙醇干预后，ALDH2表达上调，并在低剂量范围内随乙醇浓度增加而增加。低中剂量的乙醇对缺氧诱导的心肌细胞凋亡保护作用可能是或至少部分是通过上调ALDH2来实现的。
利用蛋白质组学技术分析心力衰竭大鼠线粒体差异蛋白发现[14]，ALDH2在心力衰竭大鼠中表达明显下调，实验[15]证明ALDH2具有明显的心肌保护作用，其高表达能够抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡，主要是通过将有毒性的4-HNE代谢为无毒性的4-羟壬烯酸(4-hydroxynonenal acid，4-HNA)来发挥心肌保护作用。4-HNE是不饱和脂肪酸等脂质过氧化产生的一种活性醛，在氧化应激和心肌缺血再灌注过程中4-HNE明显升高[16-18]。但是在乙醛诱导的人脐静脉内皮细胞[10]和心肌细胞凋亡[11]及乙醇诱导的肝细胞凋亡[19]中，ALDH2通过激活ERK1/2 、JNK和P38/MAPK及Akt、Pim通路发挥抗凋亡作用。
总之，关于乙醇引发心肌保护的作用机制需要更深入的探讨；ALDH2在乙醇引发心肌保护作用中发挥的作用，需要进一步研究。
图4不同浓度乙醇干预心肌细胞免疫荧光检测ALDH2表达：在低中剂量范围(5～15mmol/L)，ALDH2表达增加。Con为对照组，5，10，15为不同浓度乙醇组(mmol/L)×100
参考文献
[1]Gaziano JM, Gaziano TA, Glynn RJ, et al. Light-to-moderate alcohol consumption and mortality in the Physicians’ Health Study enrollment cohort[J] ......
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