奥曲肽联合5-氟尿嘧啶对Hepa1-6肝癌细胞PAK1表达的影响(2)
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2010年12月1日
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参见附件(3528KB，3页)。
1.3 RT-PCR法测PAK1mRNA表达 设正常肝细胞组(Z组)，对照组(A组)、奥曲肽10mg/L组(D组)、奥曲肽10mg/L+5-Fu组(G组)。常规细胞传代、培养，待细胞生长至融合后，Z、A组换新鲜培养液2ml，D组加入奥曲肽10μg/mL2ml，G组给予奥曲肽及5-Fu终浓度分别为10μg/mL、7.5mg/mL总液量2ml，培养24h，收集细胞，以Trizol试剂提取细胞总RNA，并取2mg行逆转录，PCR扩增PAK1，PAK1引物为：5，-ACCATGGTGGGAACTCCATA-3，(正义)，5，-CATCTCAAGACAGCGGTTCA-3，(反义)，片段246bp，反应条件：94℃30s，58℃1min，72℃1min30s，30个循环，以GAPDH为内参照，引物为5，-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3，(正义)，5，-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3，(反义)，片段307bp，反应终止后，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 划痕愈合实验测细胞扩散运动能力 设A、D、G组(分组同1.3实验)，将对数生长期细胞以5×105/孔接种于六孔板，每孔2ml，待细胞生长至融合，用无菌10μL加样枪头在细胞表面划痕，PBS洗去漂浮细胞，A组换新鲜培养液2ml，D、G组加药方法同1.3实验，在划痕后24h观察划痕边缘细胞向空白区扩散运动情况，并计数迁移到划痕区的细胞数，至少计数五个视野。
1.5 统计学分析 数据以(x±s)表示，比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MTT实验结果
单药OCT及联合用药组细胞生长抑制率均随药物浓度的增加而增加，与对照组相比有显著差异(P均<0.01)，且联合用药组均明显高于相应浓度OCT及5-Fu组(P均<0.05)。见表1。
2.2 各组细胞PAK1mRNA的表达
细胞PAK1mRNA经RT-PCR分析(图1)表明，正常肝细胞中仅少量表达PAK1mRNA(0.3502±0.0302)，奥曲肽10mg/L组、奥曲肽10mg/L+5-Fu组PAK1mRNA表达(分别为1.2650±0.0075、0.9715±0.0100)均较肝癌细胞组(1.499±0.0252)减少，但高于正常肝细胞组(P均<0.01)，其中奥曲肽10mg/L+5-Fu组低于奥曲肽10mg/L组(P<0.01)。见图1。
1-4：依次为正常肝细胞组、肝癌细胞组、奥曲肽10mg/L组、奥曲肽10mg/L+5-Fu组
图1各组细胞PAK1mRNA的表达
2.3 不同药物对肝癌细胞扩散运动能力的影响
肝癌细胞组、奥曲肽10mg/L组及奥曲肽10mg/L+5-Fu组，三组细胞在划痕损伤24h后肝癌细胞组划痕边缘有细胞移动，划痕面积明显缩小，划痕区内细胞数26.75±2.92，奥曲肽10mg/L组细胞划痕边缘模糊，划痕区内细胞数9±2，而奥曲肽10mg/L+5-Fu组细胞划痕边缘较整齐，划痕面内未见明显细胞移动。
3 讨论
研究发现，奥曲肽半衰期较天然生长抑素显著延长且无停药后反跳高分泌现象[4]，其对多种胃肠道肿瘤有抑制作用[5,6]，但其抗肿瘤机制目前尚未完全明了。本研究采用MTT法检测不同浓度奥曲肽、奥曲肽联合5-Fu及5-Fu对Hepa1-6肝癌细胞的抑制作用，结果显示奥曲肽联合5-Fu对细胞的抑制作用增强，且奥曲肽10mg/L联合5-Fu抑制作用最强。
PAK1(P21-activated kinase 1，P21-激活激酶1)是一潜在的癌基因，其异常已被证实与乳腺癌、大肠癌、白血病等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[7,8,9]，而其在肝癌中的表达及药物作用研究，国内外罕见报道。本研究采用RT-PCR技术检测PAK1mRNA的表达，结果显示正常肝细胞中PAK1仅少量表达，奥曲肽10mg/L联合5-Fu组、奥曲肽10mg/L组PAK1mRNA的表达均较肝癌细胞组减少，其中奥曲肽10mg/L联合5-Fu组PAK1mRNA的表达低于奥曲肽10mg/L组。提示奥曲肽10mg/L联合5-Fu通过减少PAK1癌基因的表达发挥其抗肿瘤作用。
肿瘤细胞移行是肿瘤形成的重要条件，也是肿瘤向远处器官转移所必需的。本研究我们采用划痕愈合实验观察奥曲肽及奥曲肽联合5-Fu对肝癌细胞移动能力的影响，结果显示，肝癌细胞组细胞移行运动能力最强，24h后肝癌细胞组划痕边缘有细胞移动，划痕面积明显缩小，奥曲肽10mg/L及奥曲肽10mg/L+5-Fu组细胞移行运动能力较肝癌细胞组均有不同程度下降。提示奥曲肽10mg/L联合5-Fu通过降低细胞移行能力来抑制肿瘤的增长及转移。
研究表明，10mg/L的奥曲肽联合5-Fu为抑制肿瘤的最佳药物浓度。奥曲肽联合5-Fu可通过减少PAK1癌基因的表达、降低细胞移行运动能力而抑制肿瘤的发生发展。这将为今后联合用药提供一定的理论依据。
参考文献
[1] 汤钊猷.试论原发性肝癌复发转移的研究(述评)[J].中华实验外科杂志，1999，16：485-486.
[2]陈劲松，梁庆模.生长抑素对胃肠癌的治疗[J].中国药房，2007，18(8)：632.
[3] 曹余彦，郑南，刘斌，等.5-FU、HCPT诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究[J].河北医科大学学报，2008，29(1)：33-36 ......
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