甘草甜素抗肝星状细胞增殖的相关机制研究(2)
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参见附件。
1.2.4 免疫细胞化学法(SABC法)检测PCNA、cyclinD1的表达:取对数生长期细胞,经上述相同处理后接种于置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片的24孔板中,置于37℃,5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将细胞分为4组: 空白对照组、0.8mg/L 甘草甜素组、1.2mg/L 甘草甜素组、1.6mg/L 甘草甜素组。以无血清培养基洗细胞三次,加入不同浓度甘草甜素。 甘草甜素处理24h后,4%多聚甲醛固定细胞15min, 0.3% Tri-tonX-100通透细胞30min,3%过氧化氢-甲醇液中浸泡10min,非免疫性动物血清中孵10min,加一抗(PCNA、cyclinD1单克隆抗体)4℃冰箱过夜后,生物素标记的二抗中孵育10min,加HRP标记链亲和素孵育10min(以上每次操作均用PBS洗细胞3次后再进行下一步)。然后进行DAB显色(显微镜下观察掌握显色程度):自来水充分冲洗,苏木素复染,盐酸酒精分化,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察,照相。 以PBS代替一抗作阴性对照。每组细胞各进行6次独立性实验。PCNA、cyclinD1阳性结果判断:PCNA染色:细胞核着色,染成棕黄(褐)色为阳性,浅(灰)蓝色视为阴性;cyclinD1定位于胞核,胞核染色棕黄色为阳性(cyclinD1在胞核可见棕褐色颗粒)[2],浅(灰)蓝色视为阴性。400倍镜下,PCNA、cyclinD1指数通过随机选择5个高倍视野,每视野计数100个细胞中的阳性细胞数。取平均数作为计数指标。
1.2.5 统计学分析:结果用X±s表示,数据统计分析利用SPSS 14.0软件完成,比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响:用MTT法检测了不同浓度药物对细胞增殖的影响,结果空白对照组、0.8mg/L 甘草甜素组、1.2mg/L 甘草甜素组、1.6mg/L 甘草甜素组细胞增殖抑制率分别为0,2.73%,14.75%,25.96%,甘草甜素在0.8mg/L-1.6mg/L的范围内显著抑制大鼠肝星状细胞的增殖(F=19.364,P<0.05),呈现明显的剂量依赖性(见表1)。
2.2 甘草甜素对肝星状细胞PCNA表达的影响: PCNA以细胞核表达为主,细胞质也有表达。0.8mg/L、1.2mg/L、1.6 mg/L 甘草甜素浓度组PCNA阳性表达细胞数较对照组明显减少,与对照组比较差异有显著性,具有统计学意义(F=68.329,P<0.01); PCNA阳性表达细胞数随着甘草甜素浓度的增高,阳性表达细胞数明显减少,各浓度组之间也存在显著差异(F=68.329,P<0.01) (见表2)。
2.3 甘草甜素对肝星状细胞cyclinD1表达的影响:cyclinD1以细胞核表达为主,细胞质也有表达。0.8mg/L、1.2mg/L、1.6mg/L甘草甜素浓度组cyclinD1阳性表达细胞数较对照组明显减少,与对照组比较差异有显著性,具有统计学意义(F=58.362,P<0.01);且随着甘草甜素浓度增加cyclinD1阳性表达细胞数明显减少,各浓度组之间也存在显著性差异(F=58.362,P<0.01) (见表3)。
3 讨论
肝纤维化是肝脏损伤后的异常修复反应,是细胞外基质成分在肝组织内过量生成和沉积的结果,是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段。肝星状细胞是肝脏的主要间质细胞,也是分泌细胞外基质的主要细胞,各种引起肝脏损伤的致病因素均可刺激肝星状细胞激活、增殖及转化,使细胞外基质合成增多及降解减少,继而沉积在细胞间隙,从而发生纤维化[3~4]。目前认为肝纤维化经过去除病因、护肝等治疗,部分肝纤维化可以恢复正常,但其中仍有25%~40% 最终会发展为肝硬化甚至肝癌。故近年来肝纤维化防治的研究已成为消化病学研究的热点。
复方甘草甜素为(复方甘草酸苷)是由以β-甘草酸为主要成分的复合制剂,包含甘草酸-铵,甘氨酸,L-半胱氨酸,甘氨酸-铵,DL-蛋铵酸,分子式:C42H6CO16,分子量822.94。既往研究证明甘草甜素不仅具有抗炎,抗病毒、免疫调节等多种药理作用[5],还有通过多种途径发挥抗纤维化作用[6]。同时有研究表明,甘草甜素对肝星状细胞的增殖有抑制作用[1],而甘草甜素抑制HSC的活化包括其有效性、有效剂量和可能的作用机制等,目前均未见深入报道。本研究在以往研究的基础上[6~8],选择甘草甜素 0.8 mg/L-1.6 mg/L中的3个不同剂量,用MTT法检测了不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响。本实验结果显示甘草甜素在0.8mg/L ~1.2mg/L的范围内显著抑制大鼠HSC的增殖(P<0.05),且呈现出明显的剂量依赖性,与文献[1]报道一致。
细胞增殖是肝星状细胞活化后的重要特征之一,其通过细胞周期的运行来实现,而细胞周期的调控则通过一系列的细胞周期调控蛋白(细胞周期素)的相互作用而完成。细胞周期蛋白是一种与细胞周期相关的核蛋白家族,通过与细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin depe- ndent kinases;CDKs)形成复合体并激活后者,在细胞的增殖分化中起作用。真核细胞的细胞周期由细胞周期素依次激活相应的细胞周期素依赖蛋白激酶所推动,细胞周期的不同时相由不同的cyclin控制。在非肿瘤研究中Dudas等[10]发现,培养2～7天的肝脏星状细胞cyclinD1蛋白及mRNA水平均上升,在培养8天时下降,增殖细胞核抗原(PCNA)水平变化与cyclinD1一致。cyclinD1高水平表达使cyclinE和PCNA转录,驱使细胞进入S期。
在真核细胞的细胞周期调控中,G1-S期之间的调控(restriction Point,又称R点)是细胞内外信号经传递、整合,汇集到细胞核对细胞增殖进行调控的关键点,cyclinD1是调控G1期周期蛋白之一 ......
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