酶联免疫吸附试验中的相关因素与结果分析
【中图分类号】R352【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)04-0216-01
酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay;ELISA) 是医学检验的免疫学检验方法之一，已经广泛应用到对病原微生物的免疫学检查试验中。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。用ELISA法检测乙肝病毒感染者的血清标志物(两对半)是目前最常用的实验室检验方法。和任何实验室检查方法一样，ELISA存在少量的假性结果(假阳性、假阴性)，对临床诊断和治疗会有一定的影响。由于ELISA反应所测对象可以是抗原也可以是抗体，显色反应对结果的阴性和阳性也有两种不同的判断，所以这里以显色为阳性的模式为例归纳其影响因素如下。
1 抗体的酶标记方法及标记效果测定
1.1 标记方法：良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。
酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠(NaIO4)水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时(或过夜)使之结合，然后吸出，加硼氢化钠(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜(4℃)，次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。
1.2 酶标抗体标记效果测定：测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
1.2.1 酶与抗体的活性常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。
1.2.2 结合物的定量测定一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：
酶量(mg/ml)＝OD403×0.42
IgG量(mg/ml)＝(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：
IgG量(mg/ml)＝(OD280-OD403×0.34)×0.62
已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔(mol)比值。
HRP/IgG摩尔比值＝HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4
结合物中酶总量＝HRP(mg/ml)×结合物溶液量
结合物产率＝结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时最好。酶结合率为 7%时效果一般，为9%-10%较好，达30%以上时最好。
ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA)；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
2 假阴性因素分析
2.1 试剂在生产线上，发生少见的“漏包”，或包被的抗原或抗体失活或活性不足。
2.2 试剂的运输、保管不当。如：运输过程中温度过高、保存试剂的环境不好，导致试剂中的标记物活性降低，或者中和试剂完全失活。
2.3 操作过程中的误差，加样中出现错、少、漏的现象；加显色剂速度慢，观察时间迟，使褪色反应快的出现假的阴性；洗涤过程中，用力过猛、浸泡时间太长、反复洗涤次数太多，使反应产生的免疫复合物丢失。
2.4 忽略临界值血清的作用，在试验中只做阳性对照，从而失去临界点的控制，造成假阴性。
2.5 判读结果或登记、发报告时错位，出现错报的假阴性结果。
3 假阳性时的影响因素
3.1 操作的影响。超过规定量的加样量，使临界点附近的阴性成为假的阳性；洗涤过程中有溢出现象，使强阳性孔的反应液污染附近的阴性孔而出现假的阳性；洗涤时间或次数不够，使反应试剂残留，出现假的阳性；使用污染的加样吸头或反应孔；反复使用的底物液被污染或受到强光照射时间长，也会出现假的阳性。
3.2 患者自身的免疫情况特殊。有自身免疫疾病的患者血清中，其IgG抗体等特殊成分会在ELISA反应过程中有一定的吸附作用，发生假的显色反应而出现假阳性。
3.3 血清标本的影响。如冰冻标本的反复冻融、标本存放时间太长而长菌、标本溶血、高血脂的标本等等，均易出现假的阳性结果。
3.4 酶标仪使用的影响。酶标仪是ELISA试验反应结果所必要的仪器，但在使用过程中也要注意一个特殊情况。由于酶标仪是对反应孔进行垂直比色，当反应板底部有污物时，很容易出现假的吸光度高值，导致假的阳性结果的出现。
3.5 判读结果或登记、发报告时错位，出现错报的假阳性结果。
作者单位：154600 黑龙江省大庆油田总医院, 百拇医药(李剑华)
酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay;ELISA) 是医学检验的免疫学检验方法之一，已经广泛应用到对病原微生物的免疫学检查试验中。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。用ELISA法检测乙肝病毒感染者的血清标志物(两对半)是目前最常用的实验室检验方法。和任何实验室检查方法一样，ELISA存在少量的假性结果(假阳性、假阴性)，对临床诊断和治疗会有一定的影响。由于ELISA反应所测对象可以是抗原也可以是抗体，显色反应对结果的阴性和阳性也有两种不同的判断，所以这里以显色为阳性的模式为例归纳其影响因素如下。
1 抗体的酶标记方法及标记效果测定
1.1 标记方法：良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。
酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠(NaIO4)水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时(或过夜)使之结合，然后吸出，加硼氢化钠(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜(4℃)，次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。
1.2 酶标抗体标记效果测定：测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
1.2.1 酶与抗体的活性常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。
1.2.2 结合物的定量测定一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：
酶量(mg/ml)＝OD403×0.42
IgG量(mg/ml)＝(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：
IgG量(mg/ml)＝(OD280-OD403×0.34)×0.62
已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔(mol)比值。
HRP/IgG摩尔比值＝HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4
结合物中酶总量＝HRP(mg/ml)×结合物溶液量
结合物产率＝结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时最好。酶结合率为 7%时效果一般，为9%-10%较好，达30%以上时最好。
ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA)；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
2 假阴性因素分析
2.1 试剂在生产线上，发生少见的“漏包”，或包被的抗原或抗体失活或活性不足。
2.2 试剂的运输、保管不当。如：运输过程中温度过高、保存试剂的环境不好，导致试剂中的标记物活性降低，或者中和试剂完全失活。
2.3 操作过程中的误差，加样中出现错、少、漏的现象；加显色剂速度慢，观察时间迟，使褪色反应快的出现假的阴性；洗涤过程中，用力过猛、浸泡时间太长、反复洗涤次数太多，使反应产生的免疫复合物丢失。
2.4 忽略临界值血清的作用，在试验中只做阳性对照，从而失去临界点的控制，造成假阴性。
2.5 判读结果或登记、发报告时错位，出现错报的假阴性结果。
3 假阳性时的影响因素
3.1 操作的影响。超过规定量的加样量，使临界点附近的阴性成为假的阳性；洗涤过程中有溢出现象，使强阳性孔的反应液污染附近的阴性孔而出现假的阳性；洗涤时间或次数不够，使反应试剂残留，出现假的阳性；使用污染的加样吸头或反应孔；反复使用的底物液被污染或受到强光照射时间长，也会出现假的阳性。
3.2 患者自身的免疫情况特殊。有自身免疫疾病的患者血清中，其IgG抗体等特殊成分会在ELISA反应过程中有一定的吸附作用，发生假的显色反应而出现假阳性。
3.3 血清标本的影响。如冰冻标本的反复冻融、标本存放时间太长而长菌、标本溶血、高血脂的标本等等，均易出现假的阳性结果。
3.4 酶标仪使用的影响。酶标仪是ELISA试验反应结果所必要的仪器，但在使用过程中也要注意一个特殊情况。由于酶标仪是对反应孔进行垂直比色，当反应板底部有污物时，很容易出现假的吸光度高值，导致假的阳性结果的出现。
3.5 判读结果或登记、发报告时错位，出现错报的假阳性结果。
作者单位：154600 黑龙江省大庆油田总医院, 百拇医药(李剑华)