缓衰口服液对动脉粥样硬化性肾动脉狭窄小鼠肾脏低氧—微血管荒废—肾间质纤维化的影响(2)
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2.4 肾动脉HE染色与肾间质Masson染色
肾组织用4%中性甲醛固定后常规脱水，包埋，制成3 μm厚石蜡切片，肾动脉行HE染色，肾间质行Masson染色，光镜下观察肾动脉和肾间质纤维化情况。
2.5 免疫组化观察肾脏Ⅳ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白及血管性血友病因子表达
肾脏标本脱水、浸蜡，石蜡包埋。以3 μm厚度切片，每种抗体免疫组化各2份。步骤：酶封-抗原修复-血清封闭-滴加一抗[按1∶100加入α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)多克隆抗体、兔抗大鼠Ⅳ型胶原单克隆抗体、兔抗人vWF多克隆抗体]-滴加二抗(按1∶200加入抗兔IgG抗体——HRP多聚体)-增敏二氨基联苯胺(DAB)显色液显色-复染核-封片。以胞浆出现棕黄色着色为阳性结果。
采用盲法评价：每张切片选5个肾皮质高倍视野(×200)，采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件分析肾脏中α-SMA、vWF和Ⅳ型胶原的表达，测每个视野的阳性染色面积百分比和光密度值，计算平均光密度值(光密度值/阳性面积)[6]。每张切片的阳性面积百分比和平均光密度值取5个视野的平均值，进行半定量分析。
2.6 低氧诱导因子及转化生长因子基因表达检测
用Trizol提取制备总RNA，紫外分光光度计260 nm处测定OD值，测定RNA浓度。引物由premier5.0设计软件设计，序列如下。β-actin(263 bp)上游引物：5'-GCCCAGAGCAAGACAGGTAT-3'，下游引物：5'-GGCCAT CTCCTGCTCGAAGT-3'；HIF-1α(126 bp)上游引物：5'-CAAGATCTCGGCGAAGCAA-3'，下游引物：5'-GGTGAG CCTCATAACAGAAGCTTT-3'；TGF-β(131 bp)上游引物：5'-TCTACAACCAACACAACCCG-3' ......
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