西维尔微生物限度检查方法的探讨
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[摘要]为了保证产品检查的真实性和重现性,近年来,随着药厂GMP认证的开展,药品的生产管理,由传统的产品质量控制从出厂前检验,发展到验证确立控制生产过程的运行标准,通过对已验证的状态的监控,控制整个工艺过程,确保质量的验证质量体系。本文主要对西维尔按照2005版药典的要求进行微生物限度法验证实验,从而找出适合它的微生物检查方法。
[关键词]西维尔;菌种;培养基
[中图分类号]R927
[文献标识码]B
[文章编号]1006-1959(2009)12-0254-02
1 材料与方法
1.1 试验样品:药品名称:西维尔(硒酵母片)。
1.2 验证试验的设施、设备、灭菌、器具和材料:在局部洁净度100级的单向流空气区域内进行,其环境的洁净度为10000级。检验全过程必须严格遵守无菌操作防止再污染。实验前30min需开紫外灯对实验室灭菌,同时开启超净工作台。平皿规格为直径9cm的培养皿,恒温培养箱,稀释用容器为250ml的三角烧瓶,量器为100ml的量筒。培养基及稀释液均用高压灭菌锅在121℃30min的度条件下进行灭菌进入实验室时需用紫外灯照射30min从传递窗送入,其他仪器用恒温干燥箱160℃2个小时进行灭菌,然后送入实验室。实验人员进入实验室要穿经灭菌的专用无菌服。
1.3 验证用菌种:枯草杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102(均为中国医学微生物菌种保藏管理中心保藏)。
1.4 培养基
1.4.1 营养肉汤培养基:胨10g,肉浸液1000ml,氯化钠5g,(以上药品均由牡丹江市药品检验所提供)取胨和氯化钠加入肉浸液内,微温溶解后,使用酸度计调节pH为弱碱性,煮沸,滤清,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2(灭菌后pH会下降),分装,灭菌。
1.4.2 营养琼脂培养基:照上述营养肉汤培养基的配方及制法,加入15～20g琼脂,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装,灭菌[1]。
1.5 稀释剂:pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲溶液,1%无菌氯化钠缓冲溶液。
1.6 《中国药典》有关微生物限度检查法方法验证试验。
1.6.1 菌液制备:试验菌菌液制备:将菌液采用10倍稀释法确定试验用稀释度(细菌数约为50～100cfu/ml)[2],经37℃培养18～24h,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌(由于条件问题还有2个菌种无法进行试验白色念珠菌和黑曲霉)的肉汤培养物1ml+9ml7%无菌氯化钠缓冲溶液,10倍稀释至10-5～10-7,做活菌计数备用,然后进行平皿培养,根据生长的菌数来确定其稀释度(细菌数约为50～100cfu/ml)。
供试液制备:在超净工作台上,先将药瓶和表面的锡箔用酒精70%消毒,然后在已消毒的托盘天平上称量10g西维尔加入已灭菌的研钵研磨均匀,用已灭菌的100ml量筒称取无菌pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液90ml分几次加入研钵,再转到250ml三角瓶得到浓度为1∶10供试液[3]。
1.6.2 常规法(平皿法):首先用无菌的1ml移液管吸取供试液1ml加入直径为9cm的平皿中,做一组平行样(重复操作一次),然后加入15～20ml营养琼脂培养基,混匀,待凝固后,置规定温度(30℃～35℃)培养24～48h观察结果细菌计数。
1.6.3 培养基稀释法:本试验采用稀释法来中和西维尔的抑菌性。用已灭菌的1ml移液管加0.5ml/皿供试液,再加15～20ml琼脂培养基,混匀,待凝固后,置规定温度(30℃～35℃)培养24～48h观察结果细菌计数,测定回收率 ......
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