STARD7真核表达载体的构建及肝癌细胞HepG1*2稳定转染株的建立及鉴定(1)
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2010年5月1日
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【关键词】STARD7;载体构建;转染
doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.05.010 文章编号:1006-1959(2010)-05-1035-02
SATRD7是一编码295个氨基酸残基,分子量为34.7kDa的新型蛋白质,其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析,发现其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运体结构域(START)。START涉及脂类结合介导的细胞信号转导、脂类转运和调节。START发生突变或错误表达与基因错配、自身免疫性疾病以及肿瘤相关。为了研究STARD7基因过表达后对肿瘤细胞生物学的影响,我们将STARD7基因克隆构建到真核表达载体上,并稳定转染到HEPG1*2肝癌细胞中。
1.材料和方法
1.1 材料:大肠杆菌DH-5α和人肝癌细胞系HepG1*2均由本实验室保存,pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司,M-MLV逆转录酶购自Promega公司,各种分子克隆工具酶购自MBI公司,脂质体Lipofectamine2000、Trizol试剂、G418和pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司,RPMI1640、胎牛血清(FBS)等购自GIBCOBRL公司。
1.2 方法。
1.2.1 HepG1*2总RNA的提取。按照Trizol试剂说明书步骤提取总RNA。收集所培养的HepG1*2,加TRIZOL试剂1mL,静置3~5min。加入氯仿0.5ml,混匀。室温静置2~3min后,12000r/min离心15min。于上清中加人0.5ml异丙醇,室温静置10min。10000r/min离心10min。弃上清,加入750ml/L乙醇1ml,7500r/min离心5min,干燥沉淀,加入30μL DEPC处理水。经琼脂糖凝胶电泳显示无降解后,用紫外分光光度计测定其纯度并定量,保存于-80℃备用。
1.2.2 引物设计。根据GenBank的基因序列(NM_064536),设计扩增STARD7编码区cDNA上、下游引物。上、下游引物中分别引入SamⅠ、Xhol酶切位点,扩增片段为880bp。上游5' CTCGAGATGGCGGCGTTAGCC 3',下游5' CCCGGGAGCATACTCAATC 3';内参照β-actin的引物序列为:上游5' TGTGACGTGGACATCCGCAAAG 3',下游5' TGGAAGGTGGACAGCGAGGC 3',扩增片段为206bp。并设计作为转染HepG1*2细胞后鉴定用的G418抗性基因PGK neo的特异性引物:上游5'-AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG 3',下游5'-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG 3',扩增片段为492bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。
1.2.3 逆转录合成cDNA逆转录。反应体系为:细胞总RNA 1μg,H2O 13μL,oligdT 0.5μg,70℃ 5min,立刻冰上放置,加入M-MLV 200u,dNTP 10nmol,5×M-MLV Buffer 5μL,Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 25u,混匀后42℃ 1h,70℃ 10min。取10μL反转录产物进行PCR反应,采用降落PCR(Touch down_PCR),反应条件:94℃预变性4min;94℃变性30s,63℃退火30s,72℃延伸40s扩增35个循环,72℃延伸7min。PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后,切胶回收目的片段。
1.2.4 T载体克隆。对PCR产物进行割胶纯化,将目的片段与pMD18-T载体连接。连接反应体系为:Solution I 5μL,pMD18-T DNA 50ng,PCR产物50ng,ddH2O 3μL,置于16℃ 2h后,连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态,在氨苄青霉素抗性平板上筛选生长,挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定,并命名为:pMD18-T/STARD7。
1.2.5 真核表达载体pcDNA3.1(-)/STARD7的构建用Sam I、Xho I分别双酶切重组pMD18-T/STARD7质粒及pcDNA3.1(-)空载体,凝胶电泳后回收目的片段,16℃连接10h。连接、转化,方法同前。阳性克隆经酶切鉴定后测序(Invitrogen公司)。测序正确后扩大培养,抽提重组质粒DNA。
1.2.6 细胞培养。HepG1*2细胞在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中,于37℃、50mL/LCO2饱和湿度的孵箱中培养。
1.2.7 HepG1*2细胞的基因转染和筛选培养。将处于对数生长期的HepG1*2细胞以4×105个细胞/孔接种于六孔板中,培养24h,使细胞达到80%～90%融合。用脂质体Lipofectamine2000介导空质粒及重组质粒转染细胞。转染前1h先予细胞更换无血清培养基,使细胞适应条件变更。并准备以下2种溶液,A液:4μg质粒DNA溶于150μL无血清培养液中;B液:4μL脂质体溶于150μL无血清培养液中。将A液与B液混匀,室温孵育30min,以形成DNA-脂质体复合体,加入培养液中。培养8~14h,更换为完全培养液,继续培养24h,次日于完全培养液中加入800mg/L的G418继续进行培养,2周后G418浓度改为400mg/L维持筛选。用选择培养液培养4周后,分离阳性克隆并扩大培养备用。
1.2.8 转染后STARD7表达的鉴定。分别以β-actin为内参照,对STARD7基因在转染细胞内目的基因的mRNA及蛋白表达情况进行鉴定。分别收集稳定转染空载体重组质粒的细胞,样品处理后进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、TBST缓冲液洗膜、50g/L脱脂牛奶封闭。一抗为STARD7小鼠多抗,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,ECL显色 ......
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