盐酸法舒地尔对EAE小鼠脑中ROCK-II表达的影响(2)
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2010年5月1日
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1.2.2 EAE模型的制备及神经功能评分。MOG33-35稀释液与等量含结核杆菌(TB)的CFA混合,制作抗原乳剂,按0.1ml/只给于EAE组和治疗组小鼠脊柱背侧皮下注射,佐剂组以生理盐水代替MOG33-35稀释液制成乳剂同法注射,记免疫后(p.i.)当日为d0p.i.,各组小鼠于d0p.i和d2p.i.分别给予百日咳毒素(PTX)700ng/只/次,作为免疫增强剂。治疗组于d6p.i.开始给予腹腔注射盐酸法舒地尔液(50mg/kg d),连续治疗14天。同时,EAE组和佐剂组给予同等剂量生理盐水。
采用国际通用的5分评分制对小鼠进行临床评分:0分:无任何临床症状;1分:尾部张力消失,可见轻度步态笨拙;2分:一侧后下肢无力,被动翻身后可以恢复;3分:双后肢瘫痪,被动翻身后不能恢复,但给予刺激后可以挪动;4分:双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪;5分:濒死状态或死亡。症状介于两者标准之间者以±0.5计。
1.2.3标本采集。于d18-20p.i,各组随机取8只动物,麻醉后心脏灌流,快速冰上解剖脑组织,4%多聚甲醛继续灌流,分离脊髓,制作石蜡切片,行HE染色。脑组织匀浆后提取蛋白,做Western blot检测。
1.2.4 组织学观察。组织脱蜡至水;苏木精染色15min;自来水洗20s;1%盐酸-酒精分化5~10s;自来水返蓝1~2min;伊红染色1min;自来水洗20s;梯度酒精脱水各5min;二甲苯透明2次,各10min;中性树胶封片,光镜下观察。
1.2.5 小鼠脑中ROCK-II蛋白的检测。组织匀浆,提取蛋白;BCA蛋白定量,配制胶液并灌胶;SDS-10%PAGE电泳分离;转膜,染色并照相,经TBST洗涤脱色;封闭2h;TBST洗涤4次;加一抗稀释液4℃摇育过夜;TBST洗涤洗膜;加HRP标记的二抗稀释液室温摇育1.5h;TBST洗膜;用化学发光法显色;将所得谱带照相并经图像分析软件分析相应谱带密度值。
1.2.6 统计学处理:数据均采用均数±标准差(x-±s)来表示,采用SPSS13.0软件对所得数据进行分析处理。组间临床症状评分比较采用秩和检验,其余组间比较采用单因素方差分析,率的比较采用χ2检验,P<0.05具有统计学差异。
2.结果
2.1 发病情况。EAE组小鼠从d11p.i.开始陆续发病,先是出现尾部肌张力低下,继而进展为双侧后肢无力甚至瘫痪,不能主动翻身,d18p.i.左右症状达高峰,平均行为学评分(2.571±0.690),发病率达85%。与EAE组相比,治疗组小鼠起病晚,高峰期延迟,症状较轻,发病率低,体重减轻程度明显改善。
表1 各组小鼠发病情况
分组例数平均起病时间症状高峰期平均高峰期评分
EAE组20p.i.11.8±1.303p.i.17(14-20)2.571±0.690
治疗组20p.i.13.0±0.816bp.i.19(17-21)1.485±0.324a
佐剂组20000
注:aP 0.05;bP 0.01vsEAE group。
2.2 病理改变。HE染色显示EAE组小鼠脊髓炎性浸润明显,浸润细胞以淋巴细胞和中性粒细胞为主,尤以腰膨大炎性浸润比较明显,而治疗组炎性浸润明显减轻(图1)。佐剂组小鼠脊髓未见明显异常改变。
图1 脊髓HE染色情况(1、2、3图×10,4、5、6图×40)
2.3 脑中ROCK-II表达的测定。Western blot显色谱带(见图2)显示,各组ROCK-Ⅱ在160K处有谱带显示,经图像分析后显示EAE组小鼠脊髓中ROCK-Ⅱ/β-actin密度相对值较佐剂组显著升高(P<0.01)。治疗组与EAE组相比,明显下调(P<0.01)。
泳道1:EAE组;泳道2:治疗组;泳道3:佐剂组
图2 Rock-Ⅱ的Western blot电泳图
3.讨论
EAE是研究MS的经典动物模型,MOG是唯一能引起T细胞反应和自身抗体产生的自身抗原,它直接参与CNS的体液免疫反应,是导致EAE中脱髓鞘的关键成分[3]。本实验利用MOG35-55多肽诱导C57BL/6小鼠制作EAE模型,病理学观察显示脊髓炎性浸润主要分布在脊髓前角白质、正中裂血管周围,浸润细胞以淋巴细胞为主,这些与国外报道的MOG35-55诱导的EAE模型相符[4]。
Rho/Rock信号途径是机体各组织中普遍存在的一条信号转导通路,它通过改变细胞骨架构型而介导多种刺激,是细胞行为改变最直接的信号通路。在EAE的发生发展过程中,BBB破坏使得外周活化的T淋巴细胞迁移进入CNS,引起CNS的炎性改变,有研究表明Rho/Rock信号途径活化后,通过促进内皮细胞骨架蛋白收缩,使内皮细胞间的紧密连接蛋白破坏,使BBB的通透性增加[5];同时通过调节细胞骨架蛋白重组,为T细胞的趋化、迁移、粘附等提供动力[2];在体和离体实验均表明[6],应用Rock抑制剂阻断Rho/Rock信号途径的活化,可以促进神经元和神经轴突的再生,可能会促进EAE的恢复。因为MS过程中炎症的刺激会上调Rho和Rock的表达,所以直接抑制Rock,不仅可以抑制炎细胞浸润到CNS,而且有助于神经再生,对于MS是有益的[7]。
近年来,研究发现直接应用盐酸法舒地尔对EAE有很好的治疗效果,不仅使外周特异性淋巴细胞减少,明显减轻EAE小鼠脊髓和脑中炎细胞浸润[7],而且下调了IL-17和IFN-γ/IL-4的比率[8],轴突损害减轻以及刺激神经再生等[9]作用使MS和EAE的临床症状缓解。本实验应用特异性ROCK-II抑制剂盐酸法舒地尔干预治疗EAE小鼠,结果表明盐酸法舒地尔能够明显抑制ROCK-II的活性,延缓EAE的发生,减轻CNS内炎细胞的浸润等病理改变,推测盐酸法舒地尔通过抑制ROCK-II的活化是有效抑制小鼠EAE的可能机制之一。
综合目前的研究结果,Rho/Rock信号途径与MS和EAE的发病机制密切相关,但是现有的资料仍不能清晰地证明其分子基础和细胞靶点,这些问题的阐明将对探讨EAE和MS的发病机制和寻找新的治疗方法具有特别重要的意义。
参考文献
[2] Greenwood J,Walters CE,Pryce G,et al.Lovastatin inhibits brain endothelial cell Rho-mediated lymphocyte migration and attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis[J],2003,17(8):905-907.
[3] Tsunoda I,Kuang LQ,Theil DJ,et al.Antibody association with a novel model for primary progressive multiple sclerosis:induction of relapsing-remitting and progressive forms of EAE in H2s mouse strains[J] ......
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