bFGF基因体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞研究(1)
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【摘要】目的:用Lipofectamine转染试剂介导,将重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-bFGF转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞,检测转染效果及目的基因的表达情况。材料与方法:抽取临床确诊缺血性心肌病患者髂嵴骨髓,贴壁分离法接种培养骨髓基质干细胞。绘制生长曲线。MTT比色法检测细胞活力。取第二代细胞,使用Lipofectamine转染试剂,将重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-bFGF转染骨髓基质干细胞,转染后4h、12h、24h、48h、72h以及传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿荧光蛋白的表达效率及荧光强度的变化,计算转染效率。取各观察时间点的培养上清液,酶联免疫吸附试验检测其中bFGF的浓度。转染细胞爬片行bFGF免疫组化染色检测bFGF的表达。结果:缺血性心肌病患者基质干细胞在接种后24小时开始贴壁,伸展成长梭形。MTT比色法测细胞活力达96%。在不同时间点观测EGFP表达情况,发现在转染后4h即有细胞表达绿色荧光蛋白,荧光强度和表达细胞总数在48h达高峰,72h时可见部分细胞荧光强度下降,传代后仍可观察到EGFP的表达。ELISA检测不同时间点转染上清液中分泌的bFGF浓度,结果在4h-48h内浓度呈渐进上升的趋势,在48h最高可达23.5ng/ml。转染后的部分细胞形态发生变化。转染细胞爬片行bFGF免疫组化染色证实在胞浆中有bFGF颗粒着色阳性。结论:使用Lipofectamine转染试剂可有效地转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞。转染后的培养上清可在较长时间内检测到较高浓度的bFGF的分泌。bFGF基因转染可促进骨髓基质干细胞的增殖、分化。
【关键词】基质干细胞;碱性成纤维细胞生长因子;缺血性心肌病;转染
doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.09.088文章编号:1006-1959(2010)-09-2378-02
骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)是在骨髓中存在的一类具有多向分化潜能的细胞总称,在成体动物中仍具有在特定条件下向特定组织分化的能力。正是由于骨髓基质干细胞具有向多种细胞分化的可能,并且在体外扩增迅速、来源广泛等优点,因此便成为组织工程法修复各种病损的理想种子细胞,但将其作为基因治疗的靶细胞的研究较少。它在骨髓中仅占0.25%,在成年机体中约占有核细胞的十万分之一。本实验通过脂质体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞,观察目的基因和标记基因在BMSCs中的表达情况,并观测转染对其生长增殖及表型所带来的影响。
1.材料与方法
1.1骨髓基质干细胞的体外单层培养及生长特性的检测。随机选取临床确诊为缺血性心肌病的患者,征得患者同意后,在局部麻醉下用肝素预处理过的骨髓穿刺针于髂嵴处穿刺,抽取骨髓4～6ml,置于含有15mlα-MEM(内含10%胎牛血清,100u/ml青霉素钠,100μg/ml链霉素),和肝素的液体中混匀。分2～3部分接种于10cm培养皿,于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。倒置相差显微镜观察细胞形态及增殖情况。16～18天细胞接近80%融合时传代。台盼蓝拒染试验检测细胞活性。进行生长曲线的描记。
1.2Lipofectamine介导重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-bFGF转染。转染前一天将2×105细胞接种于覆盖有清洁载玻片的35mm2培养皿内。加入2ml含10%FBS的α-MEM培养基,37℃、5%CO2、饱和湿度培养至呈60%-80%融合时转染。按说明书制备α-MEM、Lipofectamine和质粒的混合物,室温孵育后加入细胞中混匀。
1.3转染结果的检测。
1.3.1倒置荧光显微镜观察:转基因后,在暗室中用倒置荧光显微镜(OLYMPUS IX70),分别在转染后4小时、12小时、24小时、48小时、72小时,传代后24小时观察细胞中增强绿荧光蛋白(EGFP)的表达情况,采用488nm波长紫外光激发。
1.3.2转染效率的计算:沿6孔板垂直与水平经过连续视野计数EGFP阳性的细胞数,如果转染效率极低,如低于1%,则计数各孔所有EGFP表达阳性的细胞数量,共观察约20视野,按如下公式计算转染效率:转染效率=(EGFP表达阳性的细胞数/计数细胞总数)×100%。
1.3.3培养上清hBFGF-I浓度测定(bFGF ELISA kit,DSL)。取转染后各时间段的培养上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其中分泌的bFGF浓度。
1.3.4细胞爬片免疫组化染色:转染后48小时细胞爬片,丙酮固定后行bFGF免疫组化染色,观察是否有蛋白质水平的bFGF表达。
2.结果
2.1骨髓基质干细胞的培养:BMSCs在接种后24小时开始贴壁,逐渐伸展成长梭形,原代细胞呈集簇状分布,培养至8～10天可达到70%～90%融合(如图)。台盼蓝拒染实验测得细胞的活细胞率约为96%。按公式计算细胞群体倍增时间约为42.4小时。描记生长曲线发现骨髓基质干细胞的滞留期较短,在进入对数增长期后,在6～8天内持续分裂增殖,然后转为平台期,细胞增殖活力相对平稳,分裂渐趋稳定。在转基因后,BMSCs的分裂增殖过程变得活跃,细胞群体倍增时间缩短为38.3小时;细胞整体分裂相增多,部分细胞增大。
2.2转基因后倒置荧光显微镜观察:将重组质粒pIRES2-EGFP-bFGF转入BMSCs后,在4小时后即可见到部分细胞表达EGFP。最初表达的绿色荧光明亮,强度高,在4小时～48小时内表达EGFP的细胞数量逐渐增多,在48小时达到高峰,其后部分先前表达的荧光强度逐渐下降。在传代后仍可见到有EGFP表达,但大多数细胞的荧光强度较第一代略有下降。经多视野阳性细胞计数计算BMSCs的转基因效率约为19±1.3%。
2.3培养上清液中hBFGF-I浓度的测定:在不同时间点取培养上清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其中有无分泌性bFGF的表达 ......
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