拟南芥AtMGT3基因转运功能研究(2)
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制打下基础，以上还只是Mg2+转运机制的初步研究，Mg2+转运基因家族的转运机制，以及在植物体内的生物学功能，尚需更进一步的研究。
1 材料和方法
1.1 菌株的生长条件
E.coli DH5a在37℃，LB培养基中生长，并添加相应抗生素，S.typhimurium MM281需要高浓度Mg2+才可以生长，它被用于功能互补实验，于37℃，Mg2+(以MgS04的形式添加)终浓度为100mmol/L，氯霉素浓度为34mg/L的LB或N-minimal培养基中生长。
1.2 载体、酶类及各种试剂盒
pMDl8-T载体和实验中用到的所有酶类均购自大连宝生物工程有限公司，质粒纯化及胶回收试剂盒购自长沙安比奥生物技术公司，pTrc-99A由本室保存。
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1.3 AtMGT3基因的克隆及载体构建
拟南芥基因组DNA按照Robert K FlamnC的方法提取，根据AtMGT3基因序列利用PrimerPremier 5.0软件设计一对引物，正向引物序列为5′-TYGGACTCCTYCTGTYI'CACTGG-3′，反向引物序列为5′-AAGCCTAAGCTCAGCA AAAGACA-3′，用高保真酶Pyrobest DNA Polymerase进行PCR扩增，回收目的片段，连接到pMDl8-T载体上，再用EcoR I和j(pn I酶切，定向克隆至表达载体pTrc99A，并酶切鉴定阳性克隆。
1.4 生物信息学分析的主要软件及数据库
基因序列数据由NCBI中获得，跨膜区分析软件为TMHMM，多序列比对软件为ClustalW，常规的核酸蛋白分析软件利用DNAMAN进行。
, 百拇医药 1.5 表达模式分析
根据Ambiogen公司的RNA提取方法提取各个组织的总RNA：根、茎、叶、花、果；取相同量的不同组织的RNA，用eDNA合成试剂盒M-MLVReverse Transcriptase(Invitrogen公司)合成cDNA，应用软件Primer Premier 5.0设计特异的表达模式引物：正向引物序列为5′-CCTrGACCCTITGTI'TATCTATC-3′，反向引物序列为5′-CTCAGTCAAATACATCTCAGCC-3′，PCR扩增：以β-Actin作为内参，以不同组织的总eDNA作为模板进行PCR扩增，最后进行琼脂糖电泳检测。
1.6 MM281功能互补实验
挑取MM281，MM281-pTrc99A，MM281-PTrC99A-AtMGTl0，MM281，pTrc99A-AtMGT3的单菌落在试管中过夜培养，然后再按50:1(50mLLB:1 mL菌液)的比例接种于含有相应抗生素的锥形瓶中扩大培养。
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测菌OD600，当达到0.6～0.7时加入1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导至OD600达到1.0时取出转化的菌液100μL，以10的倍数稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-4mmol/L 5个浓度梯度，将稀释的菌液各取2μL点样于互补N-Minimal固体培养基上，37℃倒置培养2d，观察菌落生长情况。
1.7 液体生长曲线
挑取MM281，MM281-pTrc99A-AtMGTl0，MM281-pTrc99A-AtMGT3的单菌落在含相应抗生素的LB中摇菌，摇至OD600=0.6～0.8时，5000g离心收获细胞，用去离子水清洗两遍，以除去残留的Mg2+，然后悬浮在去离子水中，准备4种不同Mg2+浓度(100μmol/L，500μmol/L，2mmol/L，10mmol/L)和相应抗生素的N-minimal培养基，将上述准备好的培养物(起始OD600=0.001～0.002)加入N-Minimal培养基，37℃菌，24h测OD 600监测生长情况。
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1.8 阳离子敏感性实验
配制pH 7.0含0.1mol/L Mg2+的不同二价离子N-Minimal固体培养基，这些二价阳离子包含Cd2+、CO2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+，每种离子分别配制了一系列的浓度梯度(0、10、100μmol/L，1、10mmol/L)。
按功能互补实验过程一样准备好菌液，然后点至不同浓度的金属离子板上，37℃倒置培养1d后观察其生长情况并拍照。
2 结果与分析
2.1 AtMGT3的cDNA序列的结构分析
用从拟南芥基因研究中心(ACI)得到的基因信息，设计特异性引物，通过RT-PCR来扩增AtMGT3基因的预测编码区，通过测序分析，所得到AtMGl3的开放阅读框含有1266 bp的核苷，编码421AA的蛋白，其序列与AGI中心预测的序列一致，与AtMGT1相比，AtMGT3的C端序列有两个跨膜区，第1个跨膜区是Leu337和Asn379之间，第2个跨膜区是Phe391和Phe413之间，AtMGT3拥有完整的转运镁离子的结构(图1 A，B)。
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2.2 AtMGT3的表达模式
以β-Actin作为内参，对AtMGl3进行表达模式分析，通过平台期摸索，确定了Actin基因在32个循环时达到平台期；而AtMGT3基因在35个循环时达到平台期，因此，在表达模式分析中，Actin引物进行29个循环的扩增，AtMGT3引物进行32个循环的扩增，由图2可以看出，AtMGl3在根、茎、叶、花、果中都有表达，其中，在花中的表达量最高，而在根中的表达量最低。
2.3 AtMGT3可功能互补MM281的生长
MM281是一类丧失了CorA，MgtA，MgtB Mg2+转运系统的沙门氏杆菌突变株，它只能在高浓度Mg2+(>100mmol/L)下达到最佳生长速度，结合功能互补的方法，它可作为一个研究Mg2+转运的很好的系统，表达了AtMGT3的MM281重组菌株可在低浓度Mg2+情况下生长，而其阴性对照MM281，, 百拇医药(邓沛怡 田连福 陈 键 栾 升 李东屏)