不同冻存方法对组织工程骨生物活性的影响(2)
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冻存保护剂是减少冷冻损伤的另一个重要方法，其保护机制可能是防冻剂与水分子形成氢键，使最低共熔点降低，从而减轻或避免了冷冻复温过程中冰晶对细胞的损伤。由于各种冻存保护剂的作用机制不同，单一保护剂很难达到效果理想的冷冻保护要求，目前常采用多种冻存剂组成的混合保护剂。本实验采用含15%胎牛血清的DMEM培养液为基本保存液，冻存保护剂的基本成分为DMSO、羟乙基淀粉和蔗糖，3种成分按照一定浓度和比例合理搭配。DMSO具有膜通透性好和渗透性强等特点，有助于细胞克服低温保存过程中细胞内外渗透压剧烈变化引起的损伤，是目前最常采用的冻存保护剂。其作用机制是：DMSO在细胞冷冻前渗透到细胞内，可降低培养液冰点并防止游离蛋白质聚集，提高细胞膜对水的通透性。水分在冻结前渗透出细胞外形成冰晶，从而减少细胞内冰晶形成，提高细胞复苏后存活率；冷冻前渗透到细胞内的DMSO在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞结构过度脱水皱缩。羟乙基淀粉通过竞争结合水的氢原子，使冰晶生成速度减慢，减弱水的固化过程，可以降低细胞外溶质浓度过高造成的细胞损害。低分子不可渗透物质蔗糖能在降温时向细胞外转运细胞内溶质，而复温时则作用相反，从而减轻细胞渗透性损伤。虽然冻存保护剂具有保护作用，但也有一定毒性，其毒性机制可能是：通过细胞膜引起的渗透性损伤、与蛋白质和脂膜结合导致其变性的化学性损伤，毒性损伤与温度和冻存剂的含量有关。目前对于混合性冻存剂的研究主要是寻找对相应组织和细胞具有保护效果最佳、毒性最小、不同种类和不同含量冻存剂的组合。本实验采用DMSO、羟乙基淀粉和蔗糖混合物为组织工程骨的冻存保护剂，结果添加冻存剂组与不添加冻存剂组相比较，细胞周期未见明显变化，无异倍体细胞出现，复温后的组织工程骨生物活性得到了极大程度的改善，但与未行低温保存的新鲜组织工程骨相比较，其生物活性尚有一定的距离。因此，保存组织工程骨所应用的降温复温程序和速率、冻存剂含量和配方的选择如何才能做到最佳，并且方法简便、经济和实用，这些均有待于进一步研究。
编辑/张惠娟
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