猪皮肤撕脱伤CD18的表达与组织继发性坏死的研究(2)

http://www.100md.com 2007年9月1日 宋保强　郭树忠　胡亚兰　韩　岩　李　郁

     1.3 组织中CD18mRNA的表达：采用RT-PCR 法检测组织标本中CD18mRNA的表达，用 Trizol 试剂(Gibco-BRL公司)分别提取实验组和对照组组织标本中的总 RNA，用随机引物将其反转录成 cDNA 后进行 PCR 扩增，并以β-Actin为内对照。其中扩增CD18基因的上游引物为5' TTTAgAAgAACAACCCgTgC 3'；下游引物为：5' TgTTgATgCTggACgTgCAC 3'；PCR 条件为：94℃30 s，55℃60 s，72℃60 s，30个循环。反转录按照试剂盒(Promega公司)提供的说明书进行，其中CD18的扩增片断为500bp，β-Actin的扩增片断为250bp, 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用UVP凝胶成像系统进行检测，并用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测定。利用PCR胶回收试剂盒(上海华舜生物技术公司)将PCR产物从凝胶上收回，进一步亚克隆至PMD18-T载体，经转化JM109感受态细胞、筛选、小量制备质粒DNA后，用Sanger双脱氧链终止法及测序试剂盒(Amer-sham)进行序列测定。

    1.4 组织中MPO活性测定：取撕脱组织0.1g，加入0.5%溴代十六烷基三甲胺(Sigma公司)溶液2ml，用匀浆机(德国ART公司)匀浆。超声细胞粉碎仪(英国SANYO MSE公司) ......