天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料细胞相容性研究(2)
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1.3.2.1 MSC向成骨诱导：取体外扩增的第3代MSCs，以3.0×103/cm2的浓度接种于放置有无菌处理的盖玻片的六孔板中，每孔内加2ml含10% FBS的L-DMEM培养液。当细胞贴壁生长达到60%～70%汇合时，加入骨诱导剂100nM Dex、0.25mM AsA和 10mMβ-GP，进行诱导培养。对照组只加培养基。在第4、8、12和16天分别观察各孔中细胞的形态学和组织化学变化情况。
1.3.2.2 碱性磷酸酶活性测定：按碱性磷酸酶试剂盒说明进行操作。取进行诱导后的MSCs的上清液进行测定，分别取4、8、12和16天 4个时间点测定。
1.3.2.3 RT-PCR分析骨钙素mRNA：人MSC在对照组和含诱导剂培养基中分别培养7天和14天。消化后收集细胞，采用QIAGEN公司的RNeasy mini column 试剂盒提取总RNA。提取后的RNA标本经测定OD 260/280 测定比值为2.0～2.1。取1μg总RNA采用mRNA Selective PCR试剂盒进行RT-PCR反应，方法按使用说明书进行。45℃ 30min反转录，各取10μl的cDNA作为模板进行PCR反应，反应条件为：94℃30s,58℃30s，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min。产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。
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1.3.3 人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的诱导分化能力的鉴定：将hMSC接种于24孔板中，每孔细胞数为4×104个。24h后添加脂肪细胞诱导液，为高糖DMEM，内含10%FBS、0.5mmol/L异丁基-甲基黄嘌呤、0.2mmol/L吲哚美辛、10-3mmol/L地塞米松、10mg/ml胰岛素。诱导2周，每周换液2次。2周后弃去培养基，PBS洗涤3次，10%福尔马林固定，油红O染色。
1.4 天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料复合细胞培养：将支架材料制成厚0.2cm，直径1cm的圆片状，双蒸水清洗，室温下自然干燥24h，纸塑包装密封，环氧乙烷消毒。
1.4.1人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在天然羟基磷灰石/壳聚糖复合支架材料上的贴附实验：无菌条件下在超净台上将消毒的材料圆片放入24孔板，将体外扩增的hMSC经过消化离心，得到细胞悬液，按细胞密度2×l06/cm2均匀接种在材料上。加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置入细胞培养箱内培养4～6h。
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1.4.2 MTT法分析hMSCs与天然羟基磷灰石/壳聚糖复合支架材料复合培养的成活率和增殖能力：将传至第3代的细胞以1×104/ml接种于96孔培养板, 每孔加入培养基200μl,37℃, 5%CO2培养箱中培养, 分别于第2、4、6及8天,每孔加入MTT20μl，继续培养4h，吸出培养液后，加入DMSO液(150μl/孔)，室温下于微孔板振荡嚣上振荡10min，使结晶物溶解，在酶标仪上检测各孔的A值(选择波长570nm)。统计学方法对所测数据进行方差统计分析。
1.4.3碱性磷酸酶(ALP)活性测定：将支架材料3块置于六孔培养板,并设3孔为不加材料的空白对照组。将hMSCs以1×105/孔接种于预湿材料上，在条件培养基下(含抗坏血酸、地塞米松和甘油磷酸钠)培养3周后，收集细胞，采用磷酸苯二钠法测定样品ALP活性。
1.4.4扫描电镜观察：hMSCs-支架材料复合体标本取出后用2%戊二醛固定，系列丙酮中脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金，用JSM-T300扫描电镜观察细胞与材料贴附和基质分泌及生长情况。
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2结果
2.1采用密度梯度离心法成功分离获得了MSCs。用密度为1.073g/ml的Percoll对骨髓进行密度梯度离心，经过2,500rpm 30min离心后，分离得到了富含MSC的单个核细胞，将其接种于含10%经过筛选的FBS的培养基中，细胞于48h后贴壁，72h后出现纺锤状细胞(图1)，6～12天细胞生长迅速，贴壁的MSCs平均约12天后形成克隆(图2)，两周左右细胞近80%～90%汇合，出现致密的贴壁层(图3)。
2.2 MSC的生长曲线(图4)
2.3 MSCs向成骨细胞诱导分化
2.3.1 MSCs向成骨细胞诱导分化过程中的形态学变化：本实验采用包含有100nM Dex、0.25mM AsA和10mMβ-GP的骨诱导液进行MSCs向成骨细胞定向分化的实验研究。应用Von Kossa 染色和X光衍射等方法对诱导后的细胞表型进行检测和鉴定。在16天的诱导过程中，细胞形态发生明显的变化，与对照组有显著差别。在进行骨诱导第2天时，细胞形态发生改变，第4天更为明显，大约30%～40%的MSCs由纺锤状变为立方型；第8天时，实验组大约80%以上的MSCs成为立方形或多角形，细胞基质中出现钙化斑；第12天时，实验组培养皿中广泛均一地形成骨样物质，矿化物形成明显，并且开始形成多层小结结构；第16天时，成骨诱导组细胞基质形成广泛的矿化，并形成钙化结节(图5)。而对照组细胞形态仍然是纺锤状。
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2.3.2 RT-PCR分析骨钙素mRNA：RT-PCR分析，在7天、14天时诱导组中骨钙素的表达明显增高(图6)。
2.4 MSCs向脂肪细胞诱导分化：原代培养的MSC呈集落样增殖,细胞呈长梭形或长三角形,类似成纤维细胞。传代细胞第3～5代形态逐渐趋于均一的长梭形，核位于中央，细胞分布均匀。诱导36～48h后,光镜下可见部分细胞沿胞膜下出现环形细颗粒层，折光性较强，细胞核仍位于中央，以后颗粒逐渐增多，并向细胞中央、核周围逼近，颗粒逐渐变大；细胞仍呈长梭形,但胞体变大和变宽，细胞两极变短(图7)，油红O染色证实这些颗粒为中性脂肪颗粒。2～6天后，颗粒细胞明显增多，分化较早的细胞，在细颗粒增多的同时，颗粒逐渐融合成光镜下可见的小圆形脂滴，晶莹透亮，整个细胞内从胞膜到细胞核之间充满大小较均一的脂滴，呈葡萄串状(图8)，胞体明显变大，并趋于椭圆形。
2.5统计测定
2.5.1 hMSC增殖度测定：随着培养时间的延长,各组细胞数量都有所增加，各组细胞增殖度差异无显著性(P>0.05)。见表1。
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2.5.2碱性磷酸酶(ALP)活性：材料组ALP活性为(2.1259±0.1094)，空白对照组为(2.1337±0.1101)，材料组与对照组之间无显著性差异(P>0.105)，说明材料对hMSCs进行成骨细胞诱导未见不利的影响，且对诱导的成骨细胞的ALP活性没有影响。
2.5.3扫描电镜：材料表面在扫描电镜下为微粒状，具有微孔(图9)。培养4h，细胞附着于材料表面，形态多样，呈有多个突起的梭形或多角形，细胞间连接松散，细胞跨越微孔表面或向孔内长入(图10)。培养8h后细胞连接成片，可见细胞表层有丝状纤维形成(图11)。培养24h后细胞形成单层结构，细胞紧密，可见到细胞外基质(图12)。
3讨论
细胞相容性是组织工程对支架材料的最基本的要求之一。细胞培养法检测材料细胞相容性是一种快速、简便、重复性好又价廉的方法，在材料生物相容性评价中起着越来越重要的作用。体外材料复合细胞培养进行细胞相容性试验可以排除体内试验的各种复杂因素之间的相互干扰。可以从细胞水平直接观察某一单一因素所致的细胞与生物材料复合生长的情况，可以直接观察细胞对材料的趋化、粘附和细胞在材料表面及内部的生长、增殖和分化。结果较敏感和客观。, http://www.100md.com(唐晓军 归 来 吕晓迎)