大鼠颅骨矢状缝牵引成骨的体外研究(2)
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1.5 RT-PCR
1.5.1 主要试剂：Trizonl Reagent(Invitrogen，美国)，mRNA Selective PCR Ver.1.1(TaKaRa，日本)，TaKaRa Ex Taq?(TaKaRa，日本)。IGF-1、COL1A1(collagen, type I, alpha 1, COL1A1)及β-actin 引物根据Gen Bank 数据库报告序列，使用Primer Premier 5.0 软件辅助设计引物,由上海申能博彩生物技术公司合成(表2)
1.5.2 实验步骤：用于RT-PCR的30只标本，安置弹簧后分别培养0.5h、3h、6h。在解剖显微镜下将培养标本取中间矢状缝组织。先将新鲜颅缝组织剪成小块，放入匀浆器内，加入800微升Trizol用匀浆器匀浆，然后转移至新的离心管中。采用Trizol一步法提取总RNA。取RNA模板1微克，配制RT反应液50μl。将反应体系混匀，30℃10min ,42℃10min， 5℃5min进行逆转录，反应所得cDNA 产物用于PCR反应。每个样本取10μlcDNA产物, 按试剂盒说明组成PCR反应体系，体系总量50μl。β-actin 为内参。放入PCR热循环仪(Biometra公司) 内,按下列程序设置：IGF-1及β-actin：为94℃30s, 50℃30s,72℃1min,共30个循环。Ⅰ型胶原为94℃30s, 56℃30s,72℃1min, 共30个循环。
反应结束后，取PCR反应液5～10μl进行琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物，Gene Snap From Syngene软件下测定不同条带的灰度值，以每例组织电泳带面积灰度值与β-actin 电泳带面积灰度值之比作为该例标本目的基因表达的相对值，行半定量比较。各项计量指标均以平均值±标准差(x±s)表示。数据采用Excel 2003 进行汇总与绘图；统计软件SPSS 13.0进行统计分析，检验水准α＝0.05。一般性描述用 和柱形图来表示；各实验组和对照组比较采用配对样本t检验；各时间段之间比较采用两因素方差分析(Two-Way ANOVA) ......
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